Billeddannelse af podocytiske proteiner Nephrin, Actin og Podocin med udvidelsesmikroskopi
Summary
Den præsenterede metode muliggør visualisering af fluorescerende mærkede cellulære proteiner med ekspansionsmikroskopi, der fører til en opløsning på 70 nm på et konventionelt mikroskop.
Abstract
Afbrydelse af det glomerulære filter bestående af den glomerulære endotel, kugleformede kældermembran og podocytter, resulterer i albuminuria. Podocyte fodprocesser indeholder actin bundter, der binder sig til cytoskeletal adapter proteiner såsom podocin. Disse adapterproteiner, såsom podocin, forbinder rygraden i det glomerulære spaltede mellemgulv, såsom nephrin, med actin cytoskelet. At studere lokaliseringen og funktionen af disse og andre podocytiske proteiner er afgørende for forståelsen af det glomerulære filters rolle i sundhed og sygdom. Den præsenterede protokol gør det muligt for brugeren at visualisere actin, podocin og nephrin i celler med superopløsningsbilleddannelse på et konventionelt mikroskop. For det første farves celler med en konventionel immunfluorescensteknik. Alle proteiner i prøven er derefter kovalent forankret til en svulmelig hydrogel. Gennem fordøjelsen med proteinase K kløves strukturelle proteiner, hvilket tillader isotropisk hævelse af gelen i det sidste trin. Dialyse af prøven i vand resulterer i en 4-4,5 gange udvidelse af prøven, og prøven kan afbildes via et konventionelt fluorescensmikroskop, hvilket gør en potentiel opløsning på 70 nm.
Introduction
Albuminuria er en surrogatparameter for hjerte-kar-risiko og skyldes afbrydelse af det glomerulære filter1. Det kugleformede filter består af fenestrated endothelium, den kugleformede kældermembran og slidsmembran dannet af podocytter. Primære og sekundære fodprocesser af podocytter ombrydes omkring glomerulumens kapillærvæg2. Den delikate struktur af fodprocesser opretholdes af kortikale actinbundter, der også tjener som ankre for flere spaltede membranproteiner og andre adapterproteiner2. Spaltemembranens rygradprotein kaldes nephrin og interagerer på en homofil måde med nephrinmolekyler af modsatrettede podocytter. Via forskellige adapterproteiner er nephrin knyttet til actin cytoskeleton2,3. Mutationer i nephrin-kodningsgenet NPHS1 fører til nefrotisk syndrom af finsk type4.
En af nephrin’s interagerende proteiner er podocin, en hårnål-lignende protein i stomatin familien3. Podocin rekrutter nephrin til lipid flåder og links det til actin cytoskeleton5. Podocin er kodet af NPHS2 genet. Mutationer i NPHS2 føre til steroid-resistente nefrotiske syndrom6.
For at visualisere og lokalisere actin-adapterproteiner kan der anvendes immunfluorescensteknikker. Desværre begrænser lysets diffraktionsbarriere opløsningen af konventionelle fluorescensmikroskoper til 200-350 nm7. Nye mikroskopiteknikker, f.eks. stimuleret emissionsudtømning (STED)8, fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM)9, stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM eller dSTORM) eller jordtilstandssletningsmikroskopi efterfulgt af individuel molekyleretur (GSDIM)9,10,11, muliggør en opløsning på op til ca. 10 nm. Disse superopløsningsteknikker kræver imidlertid meget dyre mikroskoper, veluddannet personale og er derfor ikke tilgængelige i mange laboratorier.
Udvidelse mikroskopi (ExM) er en ny og enkel teknik, der muliggør super opløsning billeddannelse med konventionelle mikroskoper og er potentielt tilgængelig for et stort forskningsmiljø12. I proteinophobningsudvidelsesmikroskopi (proExM) fastgøres og farves prøven af interesse (celler eller væv) med fluorophorer13. Proteinerne i prøven er derefter kovalent forankret af et lille molekyle (6-((Acryloyl)amino)hexanosyre, succinimidylester, AcX) til en svulmelig hydrogel13. Gennem enzymatisk fordøjelse med proteinase K (ProK) bevarer proteiner og fluorophorer deres relative position i gelen efter ekspansion13. Efter hævelse af gelen udvides prøven op til 4,5 gange (90 gange volumetrisk ekspansion), hvilket fører til en effektiv lateral opløsning på ca. 60-70 nm (300 nm/4.5). Ændringer af denne teknik kan endda give mulighed for en 10-fold ekspansion (1.000 gange volumetrisk ekspansion), hvilket gør en opløsning på 20-30 nm på konventionelle mikroskoper14,15,16.
Glomerulære strukturer af mus og menneskelige nyrer er blevet visualiseret via ExM17. I dette papir præsenterer vi en detaljeret proExM-protokol til visualisering af superopløsningsbilleder af F-actin og actin-adapter protein podocin i celler ved hjælp af et konventionelt fluorescensmikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede metode gør det muligt for investigator at visualisere cellulære proteiner, f.eks. podocin, nephrin og cytoskeletale komponenter, f.eks. Inden for denne protokol, transfected cos7 celler bruges som en model til at studere samspillet mellem slids membran proteiner med F-actin. Desværre udtrykker udødeliggjorte podocytcellelinjer ikke tilstrækkelige endogene mængder spaltede membranproteiner19.
Med denne metode kan cellulære proteiner visualiseres …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Blanka Duvnjak og Nikola Kuhr for deres fremragende tekniske bistand.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
Riferimenti
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton – Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein – nephrin – is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
