Avbildning av podocytiske proteiner Nephrin, Actin og Podocin med ekspansjonsmikroskopi
Summary
Den presenterte metoden muliggjør visualisering av fluorescerende merkede cellulære proteiner med ekspansjonsmikroskopi som fører til en oppløsning på 70 nm på et konvensjonelt mikroskop.
Abstract
Forstyrrelse av det glomerulære filteret som består av det glomerulære endotelet, glomerulær kjellermembran og podocytter, resulterer i albuminuri. Podocyttfotprosesser inneholder aktinbunter som binder seg til cytoskeletale adapterproteiner som podocin. Disse adapterproteinene, som podocin, forbinder ryggraden i den glomerulære slitmembranen, som nephrin, til aktin cytoskjelettet. Å studere lokalisering og funksjon av disse og andre podocytiske proteiner er avgjørende for forståelsen av det glomerulære filterets rolle i helse og sykdom. Den presenterte protokollen gjør det mulig for brukeren å visualisere aktin, podocin og nephrin i celler med superoppløsningsavbildning på et konvensjonelt mikroskop. For det første er celler farget med en konvensjonell immunfluorescensteknikk. Alle proteiner i prøven er deretter kovalent forankret til en hovne hydrogel. Gjennom fordøyelsen med proteinase K er strukturelle proteiner spaltet slik at isotropisk hevelse i gelen i siste trinn. Dialyse av prøven i vann resulterer i en 4-4,5 ganger utvidelse av prøven, og prøven kan avbildes via et konvensjonelt fluorescensmikroskop, noe som gir en potensiell oppløsning på 70 nm.
Introduction
Albuminuria er en surrogatparameter for kardiovaskulær risiko og skyldes forstyrrelser i det glomerulære filteret1. Det glomerulære filteret består av det fenesterte endotelet, den glomerulære kjellermembranen og den spaltede membranen dannet av podocytter. Primære og sekundære fotprosesser av podocytter vikles rundt kapillærveggen til glomerulum2. Den delikate strukturen av fotprosesser opprettholdes av kortikale aktinbunter som også tjener som ankre for flere spaltemembranproteiner og andre adapterproteiner2. Den slit membranens ryggradsprotein kalles nephrin og samhandler på en homofil måte med nephrinmolekyler av motsatte podocytter. Via forskjellige adapterproteiner er nephrin knyttet til aktin cytoskeleton2,3. Mutasjoner i nephrinkodingsgenet NPHS1 fører til nefrotisk syndrom av finsk type4.
Et av Nephrins interagerende proteiner er podocin, et hårnållignende protein i stomatinfamilien3. Podocin rekrutterer nephrin til lipidflåter og knytter den til aktin cytoskeleton5. Podocin er kodet av NPHS2-genet. Mutasjoner i NPHS2 fører til steroidresistent nefrotisk syndrom6.
For å visualisere og samlokualisere aktinadapterproteiner, kan immunfluorescensteknikker brukes. Dessverre begrenser lysets diffraksjonsbarriere oppløsningen av konvensjonelle fluorescensmikroskop til 200-350 nm7. Nye mikroskopiteknikker, for eksempel stimulert utslippsuttømming (STED)8, fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM)9, stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM eller dSTORM) eller mikroskopi for sletting av bakketilstand etterfulgt av individuell molekylretur (GSDIM)9,10,11, muliggjør en oppløsning på opptil ca. 10 nm. Imidlertid krever disse superoppløsningsteknikkene svært dyre mikroskoper, godt trent personell og er derfor ikke tilgjengelige i mange laboratorier.
Utvidelsesmikroskopi (ExM) er en ny og enkel teknikk som muliggjør superoppløsningsavbildning med konvensjonelle mikroskoper og er potensielt tilgjengelig for et stort forskningsmiljø12. I proteinretensjon ekspansjon mikroskopi (proExM), er prøven av interesse (celler eller vev) løst og farget med fluoroforer13. Proteiner i prøven er deretter kovalent forankret av et lite molekyl (6-((Acryloyl)amino)heksanosyre, succinimidylstere, AcX) i en hovne hydrogel13. Gjennom enzymatisk fordøyelse med proteinase K (ProK) opprettholder proteiner og fluoroforer sin relative posisjon i gelen etter utvidelse13. Etter hevelse i gelen utvides prøven opptil 4,5 ganger (90 ganger volumetrisk ekspansjon) noe som fører til en effektiv lateral oppløsning på ca. 60-70 nm (300 nm / 4,5). Modifikasjoner av denne teknikken kan til og med tillate en 10 ganger utvidelse (1000 ganger volumetrisk ekspansjon), noe som gir en oppløsning på 20-30 nm på konvensjonelle mikroskoper14,15,16.
Glomerulære strukturer av mus og menneskelige nyrer har blitt visualisert via ExM17. I dette dokumentet presenterer vi en detaljert proExM-protokoll for å visualisere superoppløsningsbilder av F-aktin og actin-adapter protein podocin i celler ved hjelp av et konvensjonelt fluorescensmikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterte metoden gjør det mulig for undersøkeren å visualisere cellulære proteiner, for eksempel podocin-, nephrin- og cytoskeletalkomponenter, for eksempel F-aktin. Innenfor denne protokollen brukes transfekterte cos7-celler som en modell for å studere interaksjon av slit membranproteiner med F-aktin. Dessverre uttrykker udødelige podocyttcellelinjer ikke tilstrekkelige endogene mengder slit membranproteiner19.
Med denne metoden kan cellulære proteiner vi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Blanka Duvnjak og Nikola Kuhr for deres utmerkede tekniske assistanse.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
Riferimenti
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton – Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein – nephrin – is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
