Imagen de las proteínas podocíticas nefrina, actina y podocina con microscopía de expansión
Summary
El método presentado permite visualizar proteínas celulares etiquetadas fluorescentemente con microscopía de expansión que conduce a una resolución de 70 nm en un microscopio convencional.
Abstract
La interrupción del filtro glomerular compuesto por el endotelio glomerular, la membrana glomerular del sótano y los podocitos, resulta en albúmina. Los procesos del pie de podocito contienen haces de actina que se unen a proteínas adaptadoras citoesqueléticos como la podocina. Esas proteínas adaptadoras, como la podocina, unen la columna vertebral del diafragma de hendidura glomerular, como la nefrina, con el citoesqueleto actin. Estudiar la localización y la función de estas y otras proteínas podocíticas es esencial para la comprensión del papel del filtro glomerular en la salud y la enfermedad. El protocolo presentado permite al usuario visualizar actina, podocina y nefrina en células con imágenes de super resolución en un microscopio convencional. En primer lugar, las células se tiñen con una técnica convencional de inmunofluorescencia. Todas las proteínas dentro de la muestra se anclan covalentemente a un hidrogel hinchable. A través de la digestión con proteinasa K, las proteínas estructurales se cleaved permitiendo la hinchazón isotrópica del gel en el último paso. La diálisis de la muestra en agua da como resultado una expansión de 4-4,5 veces de la muestra y la muestra se puede imaginar a través de un microscopio de fluorescencia convencional, lo que representa una resolución potencial de 70 nm.
Introduction
Albuminuria es un parámetro sustituto del riesgo cardiovascular y resulta de la interrupción del filtro glomerular1. El filtro glomerular se compone del endotelio fenestrado, la membrana glomerular del sótano y el diafragma cortado formado por podocitos. Los procesos de pie primario y secundario de los podocitos se envuelven alrededor de la pared capilar del glomérulo2. La delicada estructura de los procesos de los pies se mantiene mediante haces corticales de actina que también sirven como anclajes para múltiples proteínas de diafragma de hendidura y otras proteínas adaptadoras2. La proteína de la columna vertebral del diafragma cortado se llama nefrina e interactúa de manera homofílica con moléculas de nefrina de podocitos opuestos. A través de diversas proteínas adaptadoras, la nefrina está vinculada al actin cytoskeleton2,3. Las mutaciones en el gen de codificación de nefrina NPHS1 conducen al síndrome nefrótico del tipofinlandés 4.
Una de las proteínas que interactúan con la nefrina es la podocina, una proteína similar a la horquilla de la familia de la estomatina3. Podocin recluta nefrina a balsas lipídicas y la vincula con el actin cytoskeleton5. La podocina está codificada por el gen NPHS2. Las mutaciones en NPHS2 conducen al síndrome nefrótico resistente a los esteroides6.
Para visualizar y co-localizar las proteínas adaptadoras de actina, se pueden utilizar técnicas de inmunofluorescencia. Desafortunadamente, la barrera de difracción de la luz limita la resolución de los microscopios de fluorescencia convencionales a 200-350 nm7. Las nuevas técnicas de microscopía, por ejemplo, el agotamiento estimulado de emisiones (STED)8,la microscopía de localización fotoactivada (PALM)9,la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM o dSTORM) o la microscopía de eliminación de estado de tierra seguida de retorno individual de moléculas (GSDIM)9,10,11,permiten una resolución de hasta aproximadamente 10 nm. Sin embargo, estas técnicas de súper resolución requieren microscopios altamente caros, personal bien capacitado y, por lo tanto, no están disponibles en muchos laboratorios.
La microscopía de expansión (ExM) es una técnica novedosa y sencilla que permite imágenes de súper resolución con microscopios convencionales y que potencialmente está disponible para una gran comunidad de investigación12. En la microscopía de expansión de retención de proteínas (proExM), la muestra de interés (células o tejidos) se fija y se tiñe con fluoróforos13. Las proteínas dentro de la muestra son entonces ancladas covalentemente por una molécula pequeña (6-((Accriloyl)amino)ácido hexanoico, éster de succinimidyl, AcX) en un hidrogel hinchable13. A través de la digestión enzimática con proteinasa K (ProK), las proteínas y fluoróforos mantienen su posición relativa dentro del gel después de la expansión13. Después de la hinchazón del gel, la muestra se expande hasta 4,5 veces (expansión volumétrica 90 veces) lo que conduce a una resolución lateral efectiva de aproximadamente 60-70 nm (300 nm/4,5). Las modificaciones de esta técnica pueden incluso permitir una expansión de 10 veces (expansión volumétrica de 1.000 veces), lo que representa una resolución de 20-30 nm en microscopios convencionales14,15,16.
Las estructuras glomerulares del ratón y los riñones humanos se han visualizado a través de ExM17. Dentro de este artículo, presentamos un protocolo proExM detallado para visualizar imágenes de súper resolución de F-actin y la podocina proteica actin-adaptador dentro de las células utilizando un microscopio de fluorescencia convencional.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado permite al investigador visualizar proteínas celulares, por ejemplo, podocina, nefrina y componentes citoesqueléticos, por ejemplo, F-actin. Dentro de este protocolo, las células cos7 transfectadas se utilizan como modelo para estudiar la interacción de proteínas de diafragma cortadas con F-actin. Desafortunadamente, las líneas celulares de podocitos inmortalizadas no expresan suficientes cantidades endógenas de proteínas de diafragma cortadas19.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Blanka Duvnjak y Nikola Kuhr por su excelente asistencia técnica.
Materials
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
Riferimenti
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