Un modèle murin pour la pancréatite chronique par perfusion de TNBS dans les voies biliaires

Summary

La pancréatite chronique (PC) est une maladie caractérisée par une inflammation et une fibrose du pancréas, souvent associée à des douleurs abdominales intraitables. Cet article se concentre sur le raffinement de la technique pour générer un modèle murin de CP par perfusion de voies biliaires avec de l’acide 2,4,6 -trinitrobenzène sulfonique (TNBS).

Abstract

La pancréatite chronique (PC) est une maladie complexe impliquant une inflammation pancréatique et une fibrose, une atrophie glandulaire, des douleurs abdominales et d’autres symptômes. Plusieurs modèles de rongeurs ont été développés pour étudier la PC, dont le modèle de perfusion d’acide sulfonique 2,4,6-trinitrobenzène (TNBS) des voies biliaires reproduit les caractéristiques de la douleur neuropathique observées dans la PC. Cependant, la perfusion de médicaments pour les voies biliaires chez la souris est techniquement difficile. Ce protocole démontre la procédure de perfusion de TNBS des voies biliaires pour la génération d’un modèle murin CP. Le TNBS a été perfusé dans le pancréas par l’ampoule de Vater dans le duodénum. Ce protocole a optimisé le volume de médicaments, les techniques chirurgicales et la manipulation des médicaments pendant la procédure. Les souris traitées par TNBS ont montré des caractéristiques de LA PC reflétées par des réductions de poids corporel et du pancréas, des changements dans les comportements associés à la douleur et une morphologie pancréatique anormale. Avec ces améliorations, la mortalité associée à l’injection de TNBS était minime. Cette procédure est non seulement essentielle pour générer des modèles de maladie pancréatique, mais est également utile dans l’administration locale de médicaments pancréatiques.

Introduction

La pancréatite chronique (PC) est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par l’atrophie du pancréas, la fibrose, les douleurs abdominales et la perte éventuelle des fonctions exocrine et endocrinienne¹. Les traitements médicaux et chirurgicaux actuels ne sont pas curatifs mais sont entrepris pour soulager les symptômes qui sont la conséquence de la maladie: douleurs abdominales réfractaires, dysfonctionnement endocrinien et exocrinien. Par conséquent, des traitements plus efficaces sont nécessaires de toute urgence². Les modèles animaux constituent un outil essentiel pour développer une meilleure compréhension de la maladie et étudier les traitements potentiels³. Plusieurs modèles murins pour la PC ont été développés, dont des modèles de céruléine et / ou d’alcool sont couramment utilisés. Il a été démontré que la céruléine, un oligopeptide stimulant la sécrétion pancréatique, induit de manière reproductible un modèle CP présentant une atrophie pancréatique, une fibrose, entre autres⁴. Un autre modèle courant utilise des injections en série de L-arginine, qui produit une insuffisance exocrine similaire à celle observée chez les patients humains⁵. La PC peut également être induite par une ligature complète ou partielle du canal pancréatique, ainsi que par une hypertension du canal pancréatique^6,7. Malgré la variété des modèles animaux disponibles pour la PC, aucun de ces modèles ne reproduit efficacement la douleur abdominale ressentie par les patients atteints de^{PC 8.}

Des études antérieures ont montré que l’injection pancréatique locale d’acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique (TNBS) reproduit la douleur persistante ressentie par les patients atteints de^{PC 9,10,11}. Les souris traitées par TNBS ont démontré une hypersensibilité abdominale et une augmentation des comportements liés à la douleur ainsi qu’une « hypersensibilité généralisée » aux stimuli douloureux, un phénomène qui a été observé chez les patients atteints de PC^10. En plus d’imiter avec précision la douleur CP, le modèle TNBS reproduit également d’autres caractéristiques pathologiques de la condition humaine telles que la fibrose, l’infiltration de cellules mononucléaires et le remplacement des cellules acineuses par du tissu adipeux^10,12. Cependant, la perfusion de TNBS par les voies biliaires est une procédure techniquement difficile chez la souris qui peut causer la mort. À notre connaissance, il n’existe aucun protocole visuel pour montrer comment la perfusion dans les voies biliaires est effectuée. Dans cet article, nous démontrons la procédure de perfusion de TNBS pour générer un modèle murin CP. Cette procédure aidera à générer des modèles animaux précieux pour l’étude de la PC et d’autres maladies du pancréas et peut être utilisée pour infuser d’autres matériaux (par exemple, virus, cellules) dans le pancréas¹³.

Protocol

Toutes les procédures ont été menées avec l’approbation des comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud et du Ralph H. Johnson Medical Center. Des souris mâles C57BL/6J âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées dans cette étude. Les souris étaient logées sous un cycle standard de 12 lumières / 12 ténèbres avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. 1. Préparation de la solution injectable de T…

Representative Results

Les procédures de perfusion des voies biliaires ont été optimisées pour réduire la mortalité des souris associée à cette procédure10. Le TNBS a d’abord été administré dans un volume total de 35 μL ou 50 μL. L’injection de TNBS dans un volume de 50 μL pourrait atteindre l’ensemble du pancréas et induire un phénotype de maladie plus homogène (Figure 1B). De plus, l’injection de TNBS à l’aide d’une seringue à insuline avec aiguille 31G pou…

Discussion

L’infusion de TNBS dans les voies biliaires pour induire une pancréatite chronique est techniquement difficile chez la souris, car jusqu’à 22,5% des souris peuvent mourir dans les 3-4 jours suivant la perfusion du médicament¹⁰. Ici, ce rapport a affiné la procédure sur la base d’études antérieures et a réduit la mortalité précoce des souris à <10%. Par exemple, l’augmentation du volume de médicaments (de 35 μL à 50 μL) peut garantir que les médicaments atteignent l’ensemb…

Materials

10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 31-gauge needle	BD	324909
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Micro clip applying forceps 5.5”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410
Micro clip, straight strong curved 1x6mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5433
Micro clip, straight, 0.75mm clip width	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5420
Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O	Millipore Sigma	92822-1ML
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416
Von Frey filaments	Bioseb	EB2-VFF