En musmodell för kronisk pankreatit via gallgång TNBS Infusion
Summary
Kronisk bukspottkörtelinflammation (CP) är en sjukdom som kännetecknas av inflammation och fibros i bukspottkörteln, ofta associerad med svårbehandlad buksmärta. Denna artikel fokuserar på att förfina tekniken för att generera en musmodell av CP via gallgångsinfusion med 2,4,6 -trinitrobensulfonsyra (TNBS).
Abstract
Kronisk bukspottkörtelinflammation (CP) är en komplex sjukdom som involverar bukspottskörtelinflammation och fibros, körtel atrofi, buksmärta och andra symtom. Flera gnagare modeller har utvecklats för att studera CP, varav gallgången 2,4,6 -trinitrobenzen sulfonic acid (TNBS) infusionsmodell replikerar funktionerna i neuropatisk smärta sett i CP. Gallgångsläkemedelsinfusion hos möss är dock tekniskt utmanande. Detta protokoll visar förfarandet för gallgång TNBS infusion för generering av en CP mus modell. TNBS infunderades i bukspottkörteln genom ampullen vater i årondenum. Detta protokoll optimerade läkemedelsvolym, kirurgiska tekniker och läkemedelshantering under proceduren. TNBS-behandlade möss visade funktioner i CP som återspeglas av kroppsvikt och bukspottkörtel viktminskning, förändringar i smärta-associerade beteenden och onormal bukspottskörteln morfologi. Med dessa förbättringar var dödligheten i samband med TNBS injektion minimal. Detta förfarande är inte bara avgörande för att generera modeller för bukspottskörtelsjukdomar utan är också användbart vid lokal läkemedelsleverans av bukspottskörteln.
Introduction
Kronisk bukspottkörtelinflammation (CP) är en kronisk inflammatorisk sjukdom som kännetecknas av bukspottkörtelns atrofi, fibros, buksmärta och eventuell förlust av både exokrina och endokrina funktioner1. Nuvarande medicinska och kirurgiska behandlingar är inte botande men utförs för att lindra symtom som är följden av sjukdomen: eldfast buksmärta, endokrin och exokrin dysfunktion. Därför behövs effektivare behandlingar brådskande2. Djurmodeller är ett viktigt verktyg för att utveckla en bättre förståelse av sjukdomen och undersöka potentiella terapier3. Flera musmodeller för CP har utvecklats, varav cerulein- och/eller alkoholmodeller används ofta. Cerulein, en oligopeptidstimulerande bukspottskörtelsekretion, har visat sig reproducerbart inducera en CP-modell med bukspottskörteln atrofi, fibros, blandandra 4. En annan vanlig modell använder seriella injektioner av L-arginin, som producerar exocrine otillräcklighet liknar den som observerats hos mänskliga patienter5. CP kan också induceras genom fullständig eller partiell bukspottskörtelkanal ligatur, liksom bukspottskörteln kanal hypertoni6,7. Trots de olika djurmodeller som finns tillgängliga för CP, reproducerar ingen av dessa modeller effektivt buksmärtan som upplevs av CP-patienter8.
Tidigare studier visade att lokal bukspottskörtelinjektion av 2,4,6-trinitrobensulfonsyra (TNBS) replikerar den ihållande smärtan hos CP-patienter 9,10,11. TNBS-behandlade möss visade buken överkänslighet och ökade smärtrelaterade beteenden samt en “generaliserad överkänslighet” mot smärtsamma stimuli, ett fenomen som har observerats hos CP patienter10. Förutom att noggrant efterlikna CP-smärta replikerar TNBS-modellen också andra patologiska egenskaper hos det mänskliga tillståndet som fibros, mononukleär cellinfiltration och ersättning av acinarceller medfettvävnad 10,12. TNBS infusion via gallgång är dock ett tekniskt utmanande förfarande hos möss som kan orsaka dödsfall. Vår kännedom om det finns inget visuellt protokoll som visar hur gallgångsinfusion utförs. I den här artikeln visar vi proceduren för galla duction infusion av TNBS för att generera en CP mus modell. Detta förfarande kommer att bidra till att generera värdefulla djurmodeller för studier av CP och andra bukspottkörtelsjukdomar och kan användas för att ingjuta andra material (t.ex. virus, celler) i bukspottkörteln13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gallgångsinfusion av TNBS för att inducera kronisk pankreatit är tekniskt utmanande hos möss, eftersom upp till 22,5% av mössen kan dö inom 3-4 dagar efter läkemedelsinfusion10. Här förfinade denna rapport förfarandet baserat på tidigare studier och minskade tidig musdödlighet till <10%. Till exempel kan den ökade läkemedelsvolymen (från 35 μL till 50 μL) säkerställa att drogerna når hela bukspottkörteln. Användning av en insulinspruta och en mindre nålstorlek (31G) minskar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Institutionen för veteranfrågor (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536) och National Institute of Health grants # 1R01DK105183, DK120394 och DK118529 till HW. Vi tackar Dr. Hongju Wu för att dela teknisk erfarenhet.
Materials
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
References
- Klauss, S., et al. Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).
- Liao, Y. H., et al. Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain. Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).
- Gui, F., et al. Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).
- Sun, Z., et al. Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice. Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).
- Aghdassi, A. A., et al. Animal models for investigating chronic pancreatitis. Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26 (2011).
- Scoggins, C. R., et al. p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).
- Bradley, E. L. Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis. The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).
- Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study. World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).
- Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain. Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).
- Cattaruzza, F., et al. Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).
- Bai, Y., et al. Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats. Molecular Brain. 12 (1), 76 (2019).
- Puig-Diví, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Zhang, Y., et al. PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment. Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).
- Ceppa, E. P., et al. Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).
- Puig-Divi, V., et al. Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts. Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).
- Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).
- Drewes, A. M., et al. Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms. Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).
