Questo protocollo presenta un nuovo modello sperimentale di coltura proinfiammatoria e degenerativa di organi bovini per simulare la degenerazione del disco intervertebrale in fase iniziale.
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Articolo metodologico
Un modello proinflammatorio di coltura degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale.
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La degenerazione del disco intervertebrale sintomatico (IVD) (IDD) è un importante fardello socioeconomico ed è caratterizzata da infiammazione e degradazione dei tessuti. A causa della mancanza di terapie causali, c'è un'urgente necessità di modelli sperimentali innovativi di coltura degli organi per studiare i meccanismi coinvolti nella progressione della malattia, trovare obiettivi terapeutici e ridurre la necessità di modelli animali. Qui presentiamo un nuovo protocollo di modello tridimensionale di coltura di organi che imita il microambiente proinfiammatorio e catabolico, presente durante l'IDD.
Inizialmente, gli IVD caudali bovini venivano sezionati, puliti e coltivati nel mezzo di coltura tissutale. Il carico fisiologico dinamico o patologico è stato applicato in un bioreattore su misura per 2 ore al giorno. Gli IVD sono stati assegnati a un gruppo di controllo (mezzo di glucosio elevato, carico fisiologico, iniezione salina tamponata da fosfati) e a un gruppo patologico (mezzo a basso glucosio, carico patologico, iniezione di fattore di necrosi tumorale-alfa) per quattro giorni. È stata eseguita l'analisi dell'espressione genica da cellule pulpose del nucleo raccolte degli IVD e il saggio immunoassorbente legato all'enzima del supporto di coltura degli organi condizionati.
I nostri dati hanno rivelato una maggiore espressione di marcatori infiammatori e una riduzione dell'altezza del disco dopo il caricamento nel gruppo patologico rispetto al gruppo di controllo. Questo protocollo è affidabile per simulare l'infiammazione e la degenerazione dell'IVD e può essere ulteriormente ampliato per ampliare il suo ambito di applicazione.
Introduzione
Lo loto antisoccito (LBP) può colpire individui di tutte le età ed è una delle principali cause di disabilità intutto il mondo 1,2,3. Il costo totale associato a LBP supera $ 100 miliardi all'anno4,5. La degenerazione del disco intervertebrale sintomatico (IVD), una condizione caratterizzata da infiammazione e degradazione dei tessuti, è una delle principali cause di LBP6,7. In particolare, l'IDD è caratterizzato da una rottura in graduale evoluzione della mat....
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Protocollo
Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando code bovine ottenute da mattatoi locali. I materiali biologici utilizzati nell'attuale studio sono prelevati dalla catena alimentare e non richiedono alcuna approvazione etica nel diritto svizzero ed europeo.
1. Dissezione del disco intervertebrale bovino
- Risciacquare accuratamente l'intera coda con acqua del rubinetto per rimuovere sporco e capelli sulla superficie.
NOTA: Con estremità distali intatte, è possibile utilizzare un massimo di 9 IVD (coccigeo 1-9) per coda per gli esperimenti a seconda della dimensione desiderata degli IVD. Considerando il diametro desiderato tra 15-2....
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Risultati
Il carico degenerativo in mezzo a basso glucosio combinato con l'iniezione di TNF-α ha causato un aumento significativo dell'espressione genica dei marcatori proinfiammatori interleuchina 6 (IL-6) e interleuchina 8 (IL-8) rispetto al gruppo di controllo fisiologico nelle cellule NP dopo 4 giorni dicoltura (Figura 2). Al contrario, non abbiamo osservato cambiamenti significativi per i geni proinflammatori interleuchina 1β (IL-1β) e TNF-α nelle cellule NP (dati non mostrati). Inoltre, le condi.......
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Discussione
Qui abbiamo fornito un protocollo dettagliato per simulare l'IVDD degenerativo e infiammatorio. Questo protocollo può essere applicato per esami dettagliati delle vie infiammatorie che portano agli effetti distruttivi sul disco. Inoltre, il protocollo può aiutare a determinare obiettivi terapeutici promettenti coinvolti nella progressione della malattia.
Recentemente abbiamo dimostrato che il TNF-α ricombinante umano potrebbe indurre infiammazione nelle cellule NP sia bovine che umane
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da AO Foundation e AOSpine International. Babak Saravi ha ricevuto il sostegno della Fondazione tedesca Spine e della Fondazione tedesca per l'osteoartrite. Gernot Lang è stato sostenuto dal Programma Berta-Ottenstein per scienziati clinici avanzati, Facoltà di Medicina, Università di Friburgo, Germania.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1-bromo-3-cloropropano(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbato-2-fosfato | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Sega a nastro | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germania | modello 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Francoforte, Germania | ||
| Bovino IL-8 Fai da te ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM Gibco ad alto contenuto di glucosio | di life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM Gibco a basso contenuto di glucosio | di life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Etanolo per la biologia molecolare | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco di life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Soluzione di aminoacidi non essenziali | Gibco di life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillina/Streptomicina (P/S) | gibco di life technologies, Carlsbad, USA | fosfato 11548876 | |
| compressa | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN, USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Paesi Bassi | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen di life Technologies, Carlsbad, USA | Kit | |
| Biosistemi applicati di life technologies | 10400745 | ||
| TaqMan Universal Master Mix | Biosystems applicati di life technologies | ||
| TNF-alfa, proteina umana ricombinante | R& D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Soluzione tampone Tris-EDTA | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Sonde | su misuraPrimer fw (5′ – 3&primo;) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′ – 3&primo;) Sonda TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT (5′ FAM/3′ TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Biosystems applicati dalle tecnologie della vita | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alfa | Biosistemi applicati dalle tecnologie della vita | Sonde su misura | Primer fw (5′ – 3&primo;) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′ – 3&primo;) Sonda GAG CTG CCC CGG AGA GTT (5′ FAM/3′ TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Biosistemi applicati da life technologies | Sonde su misura | Primer fw (5′ – 3&primo;) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′ – 3&primo;) Sonda GGT CCA GGT GTT GGA TGC A (5′ FAM/3′ TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Biosistemi applicati da life technologies | Bt03218086_m1 |
Riferimenti
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al.
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Ristampe e permessi
