Dispositivos de campo elétrico e magnético para estimulação de tecidos biológicos

Summary

Este protocolo descreve o processo passo a passo para construir estimuladores elétricos e magnéticos usados para estimular tecidos biológicos. O protocolo inclui uma diretriz para simular campos computacionais elétricos e magnéticos e fabricação de dispositivos estimuladores.

Abstract

Campos elétricos (EFs) e campos magnéticos (MFs) têm sido amplamente utilizados pela engenharia de tecidos para melhorar a dinâmica celular, como proliferação, migração, diferenciação, morfologia e síntese molecular. No entanto, variáveis como força de estímulo e tempos de estimulação precisam ser consideradas ao estimular células, tecidos ou andaimes. Dado que os EFs e os FMs variam de acordo com a resposta celular, ainda não está claro como construir dispositivos que gerem estímulos biofísicos adequados para estimular amostras biológicas. Na verdade, faltam evidências sobre o cálculo e distribuição quando são aplicados estímulos biofísicos. Este protocolo é focado no projeto e fabricação de dispositivos para gerar EFs e MFs e implementação de uma metodologia computacional para prever a distribuição de estímulos biofísicos dentro e fora de amostras biológicas. O dispositivo EF era composto por dois eletrodos paralelos de aço inoxidável localizados na parte superior e inferior das culturas biológicas. Os eletrodos foram conectados a um oscilador para gerar tensões (50, 100, 150 e 200 Vp-p) a 60 kHz. O dispositivo MF era composto por uma bobina, que foi energizada com um transformador para gerar uma corrente (1 A) e tensão (6 V) a 60 Hz. Um suporte de metacrilato de polimetila foi construído para localizar as culturas biológicas no meio da bobina. A simulação computacional elucidou a distribuição homogênea de EFs e MFs dentro e fora dos tecidos biológicos. Este modelo computacional é uma ferramenta promissora que pode modificar parâmetros como tensões, frequências, morfologias teciduais, tipos de placas de poço, eletrodos e tamanho da bobina para estimar os EFs e MFs para obter uma resposta celular.

Introduction

EFs e MFs têm sido mostrados para modificar a dinâmica celular, estimulando a proliferação e aumentando a síntese das principais moléculas associadas à matriz extracelular dos tecidos¹. Esses estímulos biofísicos podem ser aplicados de diferentes maneiras usando configurações e dispositivos específicos. Em relação aos dispositivos para gerar EFs, os estimuladores de acoplamento direto utilizam eletrodos que estão em contato com amostras biológicas in vitro ou implantados diretamente em tecidos de pacientes e animais in vivo²; no entanto, ainda existem limitações e deficiências que incluem biocompatibilidade insuficiente pelos eletrodos em contato, alterações nos níveis de pH e oxigênio molecular¹. Pelo contrário, dispositivos de acoplamento indireto geram EFs entre dois eletrodos, que são colocados em paralelo às amostras biológicas^3,permitindo uma técnica alternativa não invasiva para estimular amostras biológicas e evitar o contato direto entre tecidos e eletrodos. Esse tipo de dispositivo pode ser extrapolado para futuras aplicações clínicas para realizar procedimentos com invasão mínima ao paciente. Em relação aos dispositivos que geram MFs, estimuladores de acoplamento indutivo criam uma corrente elétrica que varia o tempo, que flui através de uma bobina que está localizada ao redor das culturas celulares^4,5. Finalmente, existem dispositivos combinados, que usam EFs e MFs estáticos para gerar campos eletromagnéticos transitórios¹. Dado que existem diferentes configurações para estimular amostras biológicas, é necessário considerar variáveis como tensão e frequência quando são aplicados estímulos biofísicos. A tensão é uma variável importante, pois influencia o comportamento dos tecidos biológicos; por exemplo, foi demonstrado que a migração celular, orientação e expressão genética dependem da amplitude da tensão aplicada^3,6,7,8,9,10. A frequência desempenha um papel importante na estimulação biofísica, pois tem sido evidenciado que estes ocorrem naturalmente in vivo. Tem sido demonstrado que frequências altas e baixas têm efeitos benéficos sobre as células; especialmente, nos canais de cálcio fechados pela tensão da membrana celular ou no ânticulo endoplasmático, que desencadeiam diferentes vias de sinalização no nível intracelular^1,7,11.

De acordo com o citado, um dispositivo para geração de EFs consiste em um gerador de tensão conectado a dois capacitores paralelos¹². Este dispositivo foi implementado por Armstrong et al. para estimular tanto a taxa de proliferação quanto a síntese molecular dos condrócitos¹³. Uma adaptação deste dispositivo foi realizada por Brighton et al. que modificaram as placas de cultura celular perfurando suas tampas superior e inferior. Os buracos foram preenchidos por lâminas de cobertura, onde os óculos inferiores eram usados para cultivar tecidos biológicos. Eletrodos foram colocados em cada slide de cobertura para gerar EFs¹⁴. Este dispositivo foi utilizado para estimular eletricamente condrócitos, osteoblastos e explantes de cartilagem, mostrando um aumento na proliferação celular^14,15,16 e síntese molecular^3,17. O dispositivo projetado por Hartig et al. consistia em um gerador de ondas e um amplificador de tensão, que estavam conectados a capacitores paralelos. Os eletrodos eram feitos de aço inoxidável de alta qualidade localizados em uma caixa isolante. O dispositivo foi utilizado para estimular os osteoblastos, mostrando um aumento significativo na proliferação e secreção de^{proteínas 18}. O dispositivo usado por Kim et al. consistia em um chip estimulador de corrente bifásica, que foi construído usando um processo de fabricação de semicondutores complementares de óxido metálico de alta tensão. Um bem-prato de cultura foi projetado para cultivar células sobre uma superfície condutiva com estimulação elétrica. Os eletrodos foram revestidos em ouro sobre placas^{de silício 19}. Este dispositivo foi utilizado para estimular os osteoblastos, mostrando um aumento na proliferação e na síntese do fator de crescimento endotelial vascular¹⁹, e estimulando a produção de atividade fosfatase alcalina, deposição de cálcio e proteínas morfogênicas^{ósseas 20}. Da mesma forma, este dispositivo foi utilizado para estimular a taxa proliferativa e a expressão do fator de crescimento endotelial vascular das células-tronco mesenquimais da medula óssea humana²¹. O dispositivo projetado por Nakasuji et al. era composto por um gerador de tensão conectado a placas de platina. Eletrodos foram construídos para medir o potencial elétrico em 24 pontos diferentes. Este dispositivo foi utilizado para estimular condrócitos, mostrando que os EFs não alteraram a morfologia celular e aumentaram a proliferação e a síntese molecular²². O dispositivo utilizado por Au et al. consistia em uma câmara de vidro equipada com duas hastes de carbono conectadas a um estimulador cardíaco com fios de platina. Este estimulador foi utilizado para estimular cardiomiócitos e fibroblastos, melhorando o alongamento celular e o alinhamento do fibroblasto²³.

Diferentes dispositivos MF foram fabricados com base em bobinas Helmholtz para estimular vários tipos de amostras biológicas. Por exemplo, as bobinas Helmholtz têm sido usadas para estimular a proliferação e a síntese molecular de conrócitos^24,25, melhorar a síntese proteoglicana das explanações de cartilagem articular^26,melhorar a regulação genética relacionada à formação óssea de células semelhantes ao osteoblasto²⁷, e aumentar a proliferação e expressão molecular das células endoteliais²⁸. As bobinas helmholtz geram MFs ao longo de duas bobinas localizadas uma na frente da outra. As bobinas devem ser colocadas com uma distância igual ao raio das bobinas para garantir uma MF homogênea. A desvantagem de usar bobinas Helmholtz está nas dimensões da bobina, porque elas precisam ser grandes o suficiente para gerar a intensidade de MF necessária. Além disso, a distância entre as bobinas deve ser adequada para garantir uma distribuição homogênea de FMs ao redor de tecidos biológicos. Para evitar problemas causados pelas bobinas helmholtz, diferentes estudos têm sido focados na fabricação de bobinas solenoides. As bobinas solenoides são baseadas em um tubo, que é ferido com fio de cobre para gerar MFs. As entradas de fio de cobre podem ser conectadas diretamente à tomada ou a uma fonte de alimentação para energizar a bobina e criar MFs no centro do solenoide. Quanto mais giros a bobina tem, maior o MF gerado. A magnitude do MF também depende da tensão e da corrente aplicada para energizar a bobina²⁹. Bobinas solenoides têm sido usadas para estimular células magneticamente diferentes, como HeLa, HEK293 e MCF7³⁰ ou células-tronco mesenquimais³¹.

Os dispositivos utilizados por diferentes autores não consideraram o tamanho adequado dos eletrodos ou o comprimento correto da bobina para distribuir homogeneamente tanto os EFs quanto os MFs. Além disso, os dispositivos geram tensões e frequências fixas, limitando seu uso para estimular tecidos biológicos específicos. Por essa razão, neste protocolo é realizada uma diretriz de simulação computacional para simular tanto sistemas capacitivos quanto bobinas para garantir a distribuição homogênea de EFs e MFs sobre amostras biológicas, evitando o efeito de borda. Além disso, mostra-se que o desenho dos circuitos eletrônicos gera tensões e frequência entre os eletrodos e a bobina, criando EFs e MFs que superarão limitações causadas pela impedância do bem-estar da cultura celular e do ar. Essas modificações permitirão a criação de bioreatores não invasivos e adaptativos para estimular qualquer tecido biológico.

Protocol

1. Simulação de EFs e MFs NOTA: A simulação de EFs e MFs foi realizada em COMSOL Multifísica. Selecione uma configuração 2D 2D axisymétrica para representar ambos os domínios elétricos e magnéticos. Na configuração física, selecione a interface Corrente Elétrica para calcular EFs em eletrodos paralelos ou a interface de campo magnético para calcular MFs em torno de bobinas. Na configuração do estudo, selecione <s…

Representative Results

Simulação computacionalAs distribuições de EFs e MFs são mostradas na Figura 3. Por um lado, foi possível observar a distribuição homogênea de EFs no sistema capacitivo (Figura 3A). A EF foi traçada para observar detalhadamente a magnitude do campo dentro da amostra biológica(Figura 3B). Esta simulação foi útil para parametrizar o tamanho dos eletrodos e fabricá-los para evitar o efeito de borda. …

Discussion

Os tratamentos utilizados para curar diferentes patologias que afetam os tecidos humanos são as terapias farmacológicas³² ou intervenções cirúrgicas^33,que buscam aliviar a dor localmente ou substituir os tecidos afetados por explantas ou transplantes. Recentemente, a terapia celular autóloga foi proposta como uma terapia alternativa para tratar tecidos feridos, onde as células são isoladas do paciente e expandidas, através de técnicas in vitro, para serem implanta…

Materials

Electrical stimulator
Operational amplifier	Motorola	LF-353N	—- Quantity: 1
Resistors	—-	—-	22 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	10 kΩ Quantity: 3
Resistors	—-	—-	2.6 kΩ Quantity: 2
Resistors	—-	—-	2.2 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	1 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	220 Ω Quantity: 2
Resistors	—-	—-	22 Ω Quantity: 5
Resistors	—-	—-	10 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	6.8 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	3.3 Ω Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	1 nF Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	100 nF Quantity: 1
VHF Band Amplifier Transistor JFET	Toshiba	2SK161	—- Quantity: 1
Power transistor BJT NPN	Mospec	TIP 31C	—- Quantity: 1
Zener diode	Microsemi	1N4148	—- Quantity: 1
Switch	Toogle Switch	SPDT – T13	—- Quantity: 3
Toroidal ferrite core	Caracol	—-	T*22*14*8 Quantity: 1
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 24 Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	8 pin connectors Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	2 pin connectors Quantity: 1
Female plug terminal connector	JIALUN	—-	4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1
Aluminum Heat Sink	AWIND	—-	For TIP 31C transistor Quantity: 1
Led	CHANZON	—-	5 mm red Quantity: 1
Integrated circuit socket connector	Te Electronics Co., Ltd.	—-	Double row 8-pin DIP Quantity: 1
3 pin connectors set	STAR	—-	JST PH 2.0 Quantity: 3
2 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
3 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
Banana connector test lead	JIALUN	—-	P1041 – 4 mm – 15 A Quantity: 7
Bullet connectors to banana plug charge lead	JIALUN	—-	4 mm male-male/female-female adapters – 15 A Quantity: 1
Case	—-	—-	ABS Quantity: 1
Electrodes	—-	—-	Stainless – steel Quantity: 2
Electrode support	—-	—-	Teflon Quantity: 2
Printed circuit board			Quantity: 1
Magnetic stimulator
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 18 Quantity: 1
AC power plugs	—-	—-	120 V AC – 60 Hz Quantity: 1
Banana female connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm – 15 A Quantity: 2
Banana male connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm 15 A Quantity: 1
Cell culture well plate support	—-	—-	PMMA Quantity: 1
Fuse	Bussmann	2A	—- Quantity: 1
Transformer	—-	—-	1A – 6 V AC Quantity: 1
Tube	—-	—-	PVC Quantity: 1
Variable rheostat	MCP	BXS150	10 Ω Quantity: 1
General equipment
Digital dual source	PeakTech	DG 1022Z	2 x 0 – 30 V / 0 – 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1
Digital Oscilloscope	Rigol	DS1104Z Plus	100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1
Digital multimeter	Fluke	F179	Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1