Elektriske og magnetiske feltenheter for stimulering av biologisk vev

Summary

Denne protokollen beskriver den trinnvise prosessen for å bygge både elektriske og magnetiske stimulatorer som brukes til å stimulere biologisk vev. Protokollen inkluderer en retningslinje for å simulere beregningsmessig elektriske og magnetiske felt og produksjon av stimulatorenheter.

Abstract

Elektriske felt (EFer) og magnetiske felt (MFs) har blitt mye brukt av vevsteknikk for å forbedre celledynamikken som spredning, migrasjon, differensiering, morfologi og molekylær syntese. Variabler som stimuli styrke og stimuleringstider må imidlertid vurderes ved stimulering av enten celler, vev eller stillaser. Gitt at EFer og MFs varierer i henhold til cellulær respons, er det fortsatt uklart hvordan man bygger enheter som genererer tilstrekkelig biofysiske stimuli for å stimulere biologiske prøver. Faktisk er det mangel på bevis angående beregning og distribusjon når biofysiske stimuli påføres. Denne protokollen er fokusert på design og produksjon av enheter for å generere EFer og MFs og implementering av en beregningsmetodikk for å forutsi biofysisk stimulifordeling i og utenfor biologiske prøver. EF-enheten bestod av to parallelle elektroder i rustfritt stål plassert øverst og nederst i biologiske kulturer. Elektroder ble koblet til en oscillator for å generere spenninger (50, 100, 150 og 200 Vp-p) ved 60 kHz. MF-enheten var sammensatt av en spole, som ble strømførende med en transformator for å generere en strøm (1 A) og spenning (6 V) ved 60 Hz. En polymetylmetakrylatstøtte ble bygget for å lokalisere de biologiske kulturene midt i spolen. Beregningssimuleringen belyste den homogene fordelingen av EFer og MFs i og utenfor biologisk vev. Denne beregningsmodellen er et lovende verktøy som kan endre parametere som spenninger, frekvenser, vevsmorfologier, brønnplatetyper, elektroder og spolestørrelse for å estimere EFs og MFs for å oppnå en cellulær respons.

Introduction

EFer og MFs har vist seg å endre celledynamikk, stimulere spredning og øke syntesen av de viktigste molekylene knyttet til den ekstracellulære matrisen av vev¹. Disse biofysiske stimuliene kan brukes på forskjellige måter ved å bruke spesifikke innstillinger og enheter. Når det gjelder enhetene for å generere EFer, bruker direkte koblingstimulatorer elektroder som er i kontakt med biologiske prøver in vitro eller implantert direkte i vev av pasienter og dyr in vivo²; Det er imidlertid fortsatt begrensninger og mangler som inkluderer utilstrekkelig biokompatibilitet av elektrodene i kontakt, endringer i pH og molekylær oksygennivå¹. Tvert imot genererer indirekte koblingsenheter EFer mellom to elektroder, som er plassert parallelt med biologiske prøver³, slik at en ikke-invasiv alternativ teknikk kan stimulere biologiske prøver og unngå direkte kontakt mellom vev og elektroder. Denne typen enhet kan ekstrapoleres til fremtidige kliniske applikasjoner for å utføre prosedyrer med minimal invasjon til pasienten. I forhold til enheter som genererer MFer, skaper induktive koblingstimulatorer en tidsvarierende elektrisk strøm, som strømmer gjennom en spole som ligger rundt cellekulturer^4,5. Til slutt er det kombinerte enheter, som bruker EFer og statiske MFer til å generere forbigående elektromagnetiske felt¹. Gitt at det er forskjellige konfigurasjoner for å stimulere biologiske prøver, er det nødvendig å vurdere variabler som spenning og frekvens når biofysiske stimuli påføres. Spenning er en viktig variabel, siden den påvirker oppførselen til biologisk vev; For eksempel har det vist seg at cellemigrasjon, orientering og genuttrykk avhenger av amplituden til anvendt spenning^3,6,7,8,9,10. Frekvens spiller en viktig rolle i biofysisk stimulering, da det har blitt bevist at disse forekommer naturlig in vivo. Det har vist seg at høye og lave frekvenser har gunstige effekter på celler; spesielt i cellemembranspenningsporterte kalsiumkanaler eller endoplasmic retikulum, som utløser forskjellige signalveier på intracellulært nivå^1,7,11.

I følge ovennevnte består en enhet for å generere EFer av en spenningsgenerator koblet til to parallelle kondensatorer¹². Denne enheten ble implementert av Armstrong et al. for å stimulere både spredningshastigheten og den molekylære syntesen av kondrocytter¹³. En tilpasning av denne enheten ble utført av Brighton et al. som modifiserte cellekulturbrønnplater ved å bore topp- og bunnlokkene. Hullene ble fylt av dekselsklier, hvor bunnbrillene ble brukt til å dyrke biologisk vev. Elektroder ble plassert på hvert dekselsklie for å generere EFer¹⁴. Denne enheten ble brukt til å stimulere kondrocytter, osteoblaster og bruskplanter elektrisk, noe som viser en økning i celleproliferasjon^14,15,16 og molekylær syntese^3,17. Enheten designet av Hartig et al. besto av en bølgegenerator og en spenningsforsterker, som var koblet til parallelle kondensatorer. Elektroder ble laget av rustfritt stål av høy kvalitet plassert i et isolerende etui. Enheten ble brukt til å stimulere osteoblaster, som viser en betydelig økning i spredning og proteinsekresjon¹⁸. Enheten som brukes av Kim et al. besto av en bifasisk strømstimulatorbrikke, som ble bygget ved hjelp av en produksjonsprosess av komplementære halvledere av høyspent metalloksid. En kulturbrønnplate ble designet for å dyrke celler over en ledende overflate med elektrisk stimulering. Elektroder ble belagt i gull over silisiumplater¹⁹. Denne enheten ble brukt til å stimulere osteoblaster, som viser en økning i spredning og syntese av vaskulær endotel vekstfaktor¹⁹, og stimulerer produksjonen av alkalisk fosfataseaktivitet, kalsiumavsetning og benmorfogene proteiner²⁰. På samme måte ble denne enheten brukt til å stimulere spredningshastigheten og uttrykket for vaskulær endotel vekstfaktor for menneskelig benmarg mesenchymale stamceller²¹. Enheten designet av Nakasuji et al. var sammensatt av en spenningsgenerator koblet til platinaplater. Elektroder ble bygget for å måle det elektriske potensialet på 24 forskjellige punkter. Denne enheten ble brukt til å stimulere kondrocytter, som viste at EFer ikke endret cellemorfologi og økt spredning og molekylær syntese²². Enheten som brukes av Au et al. besto av et glasskammer utstyrt med to karbonstenger koblet til en hjertestimulator med platinatråder. Denne stimulatoren ble brukt til å stimulere kardiomyocytter og fibroblaster, forbedre celleforlengelse og fibroblastjustering²³.

Ulike MF-enheter er produsert basert på Helmholtz-spoler for å stimulere til flere typer biologiske prøver. For eksempel har Helmholtz-spoler blitt brukt til å stimulere spredning og molekylær syntese av kondrocytter^24,25, forbedre proteoglykansyntese av leddbrusk explants²⁶, forbedre gen upregulering relatert til beindannelse av osteoblastlignende celler²⁷, og øke spredning og molekylær uttrykk for endotelceller²⁸. Helmholtz-spoler genererer MFs gjennom to spoler som ligger den ene foran den andre. Spolene må plasseres med en avstand som er lik spolens radius for å sikre en homogen MF. Ulempen med å bruke Helmholtz-spoler ligger i spoledimensjonene, fordi de må være store nok til å generere den nødvendige MF-intensiteten. I tillegg må avstanden mellom spoler være tilstrekkelig for å sikre en homogen fordeling av MFs rundt biologisk vev. For å unngå problemer forårsaket av Helmholtz-spoler, har forskjellige studier vært fokusert på solenoidspoler produksjon. Solenoidspoler er basert på et rør, som er såret med kobbertråd for å generere MFs. Kobbertrådinnganger kan kobles direkte til stikkontakten eller en strømforsyning for å energisere spolen og lage MFs i midten av spolen. Jo flere svinger spolen har, jo større genereres MF. MF-størrelsen avhenger også av spenningen og strømmen som påføres for å energisere spolen²⁹. Solenoidspoler har blitt brukt til å stimulere magnetisk forskjellige typer celler som HeLa, HEK293 og MCF7³⁰ eller mesenchymale stamceller³¹.

Enheter som brukes av forskjellige forfattere har ikke vurdert verken tilstrekkelig størrelse på elektroder eller riktig lengde på spolen for homogent å distribuere både EFer og MFs. Videre genererer enheter faste spenninger og frekvenser, noe som begrenser bruken av dem til å stimulere spesifikke biologiske vev. Av denne grunn utføres en beregningssimuleringsretningslinje i denne protokollen for å simulere både kapasitive systemer og spoler for å sikre homogen distribusjon av EFer og MFs over biologiske prøver, og unngå kanteffekten. I tillegg er det vist at utformingen av elektroniske kretser genererer spenninger og frekvens mellom elektrodene og spolen, og skaper EFer og MFs som vil overvinne begrensninger forårsaket av impedans av cellekulturens brønnplater og luft. Disse modifikasjonene vil tillate opprettelse av ikke-invasive og adaptive bioreaktorer for å stimulere ethvert biologisk vev.

Protocol

1. Simulering av EFer og MFs MERK: Simulering av EFer og MFs ble utført i COMSOL Multiphysics. Velg en aksisymmetrisk 2D-konfigurasjon som representerer både domener som er elektriske og magnetiske. I den fysiske konfigurasjonen velger du enten det elektriske strømgrensesnittet for å beregne EFer i parallelle elektroder eller magnetfeltgrensesnittet for å beregne MFer rundt spoler. I studiekonfigurasjonen velger du Fr…

Representative Results

BeregningssimuleringDistribusjoner av EFer og MFer vises i figur 3. På den ene siden var det mulig å observere den homogene fordelingen av EFer i kapasitivsystemet (figur 3A). EF ble plottet inn for å observere i detalj størrelsen på feltet inne i den biologiske prøven (Figur 3B). Denne simuleringen var nyttig for å parametrize størrelsen på elektrodene og produsere dem for å unngå kanteffekten. På d…

Discussion

Behandlinger som brukes til å helbrede forskjellige patologier som påvirker humant vev er farmakologiske terapier³² eller kirurgiske inngrep³³, som søker å lindre smerte lokalt eller erstatte berørte vev med explants eller transplantasjoner. Nylig har autolog celleterapi blitt foreslått som en alternativ terapi for å behandle skadet vev, hvor celler er isolert fra pasienten og utvidet, gjennom in vitro-teknikker, som skal implanteres på skadestedet^…

Materials

Electrical stimulator
Operational amplifier	Motorola	LF-353N	—- Quantity: 1
Resistors	—-	—-	22 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	10 kΩ Quantity: 3
Resistors	—-	—-	2.6 kΩ Quantity: 2
Resistors	—-	—-	2.2 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	1 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	220 Ω Quantity: 2
Resistors	—-	—-	22 Ω Quantity: 5
Resistors	—-	—-	10 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	6.8 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	3.3 Ω Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	1 nF Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	100 nF Quantity: 1
VHF Band Amplifier Transistor JFET	Toshiba	2SK161	—- Quantity: 1
Power transistor BJT NPN	Mospec	TIP 31C	—- Quantity: 1
Zener diode	Microsemi	1N4148	—- Quantity: 1
Switch	Toogle Switch	SPDT – T13	—- Quantity: 3
Toroidal ferrite core	Caracol	—-	T*22*14*8 Quantity: 1
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 24 Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	8 pin connectors Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	2 pin connectors Quantity: 1
Female plug terminal connector	JIALUN	—-	4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1
Aluminum Heat Sink	AWIND	—-	For TIP 31C transistor Quantity: 1
Led	CHANZON	—-	5 mm red Quantity: 1
Integrated circuit socket connector	Te Electronics Co., Ltd.	—-	Double row 8-pin DIP Quantity: 1
3 pin connectors set	STAR	—-	JST PH 2.0 Quantity: 3
2 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
3 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
Banana connector test lead	JIALUN	—-	P1041 – 4 mm – 15 A Quantity: 7
Bullet connectors to banana plug charge lead	JIALUN	—-	4 mm male-male/female-female adapters – 15 A Quantity: 1
Case	—-	—-	ABS Quantity: 1
Electrodes	—-	—-	Stainless – steel Quantity: 2
Electrode support	—-	—-	Teflon Quantity: 2
Printed circuit board			Quantity: 1
Magnetic stimulator
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 18 Quantity: 1
AC power plugs	—-	—-	120 V AC – 60 Hz Quantity: 1
Banana female connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm – 15 A Quantity: 2
Banana male connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm 15 A Quantity: 1
Cell culture well plate support	—-	—-	PMMA Quantity: 1
Fuse	Bussmann	2A	—- Quantity: 1
Transformer	—-	—-	1A – 6 V AC Quantity: 1
Tube	—-	—-	PVC Quantity: 1
Variable rheostat	MCP	BXS150	10 Ω Quantity: 1
General equipment
Digital dual source	PeakTech	DG 1022Z	2 x 0 – 30 V / 0 – 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1
Digital Oscilloscope	Rigol	DS1104Z Plus	100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1
Digital multimeter	Fluke	F179	Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1