אתר ספציפי ליסין אצטילציה של היסטונים עבור שחזור Nucleosome באמצעות הרחבת קוד גנטי ב Escherichia קולי
Summary
כאן אנו מציגים שיטה לבטא חלבוני histone אצטילאט באמצעות הרחבת קוד גנטי להרכיב נוקלאוזומים מחדש במבחנה.
Abstract
חלבוני histone אצטילאט יכול לבוא לידי ביטוי בקלות ב Escherichia coli קידוד מוטציה, Nε-אצטיל-ליצין (AcK) ספציפי מתנוסרצ’ינה מזי פירוסין tRNA-סינתטאז (MmAcKRS1) ו tRNA קוגנטיבי שלה (tRNAPyl)להרכיב מונונוקלאוזומים משוחזרים עם היסטון אצטילאט ספציפי לאתר. MmAcKRS1 ו- tRNAPyl מספקים AcK באתר מוטציה ענבר ב mRNA של בחירה במהלך התרגום ב Escherichia coli. טכניקה זו שימשה בהרחבה כדי לשלב AcK באתרי ליזין H3. סינתזת Pyrrolysyl-tRNA (PylRS) ניתן גם להתפתח בקלות לשלב חומצות אמינו לא קאנוניות אחרות (ncAAs) עבור שינוי חלבון ספציפי לאתר או פונקציונליזציה. כאן אנו מפרטים שיטה לשלב AcK באמצעות מערכת MmAcKRS1 לתוך H3 histone ולשלב חלבוני H3 אצטילאט לתוך mononucleosomes מחדש. מונונוקלאוזומים משוחזרים אצטילאטים יכולים לשמש מבחנים ביוכימיים ומחייבים, קביעת מבנה ועוד. השגת מונונוקלאוזומים מותאמים היא חיונית לתכנון ניסויים הקשורים לגילוי אינטראקציות חדשות והבנת אפיגנטיקה.
Introduction
השתמשנו ב-PylRS וב-tRNAPyl כדי לסנתז ולהרכיב מונונוקלאוזומים משוחזרים עם היסטוני אצטילציה ספציפיים לאתר. PylRS הוכיחה את עצמה ככלי להרחבת קוד גנטי לייצור חלבונים עם שינויים לאחר תרגום (PTMs) והתפתחה גנטית כדי לשלב כ -200 ncAAs שונים. PylRS משלבת בקודון עצירת ענבר, הסרת תחרות מחומצות אמינו אחרות במהלך התרגום. PylRS התגלה לראשונה בארכיאולוגיה מתנוגנית, ומאז נוצל בביולוגיה כימית כדי לשלב קבוצות כימיות תגובתיות חדשניות לחלבונים1,2.
MmAcKRS1 התפתח מ מתנוזרצ’ינה mazei PylRS ומשמש לעתים קרובות במעבדה שלנו לסינתזה של חלבונים acetylated3,4,5,6. MmAcKRS1 מספק AcK באתר מוטציה ענבר mRNA של בחירה במהלך התרגום ב Escherichia קולי. טכניקה זו שימשה בעבר לשלב AcK ב K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, ו K79 היסטון H3 לידין אתרים ללמוד את הפעילות של Sirtuin 1, 2, 6, ו 7 על מונונוקלאוזומים acetylated4,5,6. כאן אנו מפרטים שיטה זו כדי להביע היסטונים אצטילאטים ו לבנות מחדש נוקלאוזומים acetylated.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה חיוני כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה בכל פרט במהלך ניסוי. Nucleosomes אינם יציבים מאוד הרבה ניסוי וטעייה נכנסה לתוך קביעת פרוטוקול זה. זה המפתח להסרת משקעים בכל שלב (או בכל פעם שנצפה) כי חלקיקים יכולים בקלות להפריע לתהליכי ההרכבה. תמיד לשמור דגימות היסטון על קרח. אם נוקלאוזומים מאוחסנים ב 4 מעלות צל…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר ווסלי וונג על הנחת היסודות לפרוטוקול הזה ולחונכותו החשובה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענקים R01GM127575 ו R01GM121584) וקרן וולש (גרנט A-1715).
Materials
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
Riferimenti
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2′-5′-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2′,5′)pA(3′,5′)p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
