大腸菌の遺伝子コード拡張を用いた核組換えのためのヒストンの特異的なリジンアセチル化
Summary
ここでは、遺伝子コード拡張を用いてアセチル化ヒストンタンパク質を発現し、再構成されたヌクレオソームをインビトロで組み立てる方法を紹介する。
Abstract
アセチル化ヒストンタンパク質は、変異体をコードする大腸菌、N ε-アセチルリジン(AcK)特異的メタノサルシナマジピロリシンtRNA合成酵素(MmAcKRS1)およびその同系tRNA(tRNAPyl)を組み立てるために容易に発現することができる。MmAcKRS1 および tRNAPylは、大腸菌での翻訳中に選択した mRNA の中で、黄色の変異部位で AcK を送達します。この技術は、H3リジンサイトでAcKを組み込むために広く使用されています.ピロリシル-tRNA合成酵素(PylRS)は、部位特異的なタンパク質修飾または機能化のために他の非カノニカルアミノ酸(ncAAs)を組み込むために容易に進化させることができる。ここでは、MmAcKRS1システムを用いたAcKをヒストンH3に組み込み、アセチル化H3タンパク質を再構成された単核球体に統合する方法を詳述する。アセチル化再構成単核体は、生化学的および結合アッセイ、構造決定、およびよりに使用することができる。新しい相互作用の発見やエピジェネティクスの理解に関連する実験を設計するには、改変単核体を得ることが重要です。
Introduction
我々は、PylRSおよびtRNAPylを利用して、部位特異的アセチル化ヒストンを有する再構成単核体を合成および組み立てる。PylRSは、翻訳後修飾(PTM)を用いてタンパク質を産生する遺伝コード拡張ツールとして非常に価値があることが証明されており、約200の異なるncAAを組み込むために遺伝的に進化してきました。PylRSは、アンバーストップコドンで組み込み、翻訳中に他のアミノ酸との競合を除去します。PylRSは、メタノジェニック古風で初めて発見され、その後、新しい反応性化学基をタンパク質1,2に組み込むために化学生物学に利用されている。
MmAcKRS1はメタノサルシナ・メイジ・ピルスから進化し、アセチル化タンパク質3、4、5、6の合成のために私たちの研究室で頻繁に使用されました。MmAcKRS1は、大腸菌での翻訳中に選択したmRNAの中で、黄色の突然変異部位でAcKを提供する。この技術は、以前にK4、K9、K14、K18、K23、K27、K36、K56、K64、およびK79ヒストンH3リシン部位にAcKを組み込み、アセチル化単核体4、5、6にサーチュイン1、2、6、および7の活性を研究するために使用されてきた。ここでは、アセチル化ヒストンを発現し、アセチル化ヌクレオソームを再構成するこの方法を詳述する。
Protocol
Representative Results
Discussion
実験中にこのプロトコルを詳細に従うことは不可欠です。ヌクレオソームは非常に安定しておらず、多くの試行錯誤がこのプロトコルを決定することに入っています。粒子状物は容易に組み立てプロセスを妨げる可能性があるので、すべてのステップ(または観察されるたびに)で沈殿物を除去することが重要です。常にヒストンサンプルを氷の上に置いてください。ヌクレオソームが4°Cで長?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この議定書と彼の貴重な指導の基礎を築いてくれたウェスリー・ワン博士に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(グランツR01GM127575およびR01GM121584)およびウェルチ財団(グラントA-1715)によって部分的に支援されました。
Materials
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
Riferimenti
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