Stedsspesifikk lysinacetylering av histoner for nukleosomrekonstituering ved bruk av genetisk kodeutvidelse i Escherichia coli
Summary
Her presenterer vi en metode for å uttrykke acetylerte histoneproteiner ved hjelp av genetisk kodeutvidelse og montere rekonstituerte nukleosomer in vitro.
Abstract
Acetylerte histoneproteiner kan lett uttrykkes i Escherichia coli som koder for mutant, Nε-acetyl-lysin (AcK)-spesifikk Methanosarcina mazi pyrrolysin tRNA-syntetase (MmAcKRS1) og dens konjatur tRNA (tRNAPyl) for å montere rekonstituerte mononukleosomer med site spesifikke acetytonert hissyton. MmAcKRS1 og tRNAPyl leverer AcK på et gult mutasjonssted i mRNA etter eget valg under oversettelse i Escherichia coli. Denne teknikken har blitt brukt mye for å innlemme AcK på H3 lysinsteder. Pyrrolysyl-tRNA-syntetase (PylRS) kan også enkelt utvikles for å inkorporere andre ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAer) for stedsspesifikk proteinmodifisering eller funksjonalisering. Her beskriver vi en metode for å inkorporere AcK ved hjelp av MmAcKRS1-systemet i histone H3 og integrere acetylerte H3-proteiner i rekonstituerte mononukleosomer. Acetylerte rekonstituerte mononukleosomer kan brukes i biokjemiske og bindende analyser, strukturbestemmelse og mer. Å skaffe modifiserte mononukleosomer er avgjørende for å designe eksperimenter knyttet til å oppdage nye interaksjoner og forstå epigenetikk.
Introduction
Vi har brukt PylRS og tRNAPyl til å syntetisere og montere rekonstituerte mononukleosomer med stedsspesifikke acetylerte histoner. PylRS har vist seg uvurderlig som et genetisk kodeutvidelsesverktøy for å produsere proteiner med postoversettelsesendringer (PTMer) og har blitt genetisk utviklet for å innlemme rundt 200 forskjellige ncAAer. PylRS inkorporerer på en gul stopp codon, fjerne konkurranse fra andre aminosyrer under oversettelse. PylRS ble først oppdaget i metanogene arkaea, og har siden blitt brukt i kjemisk biologi for å innlemme nye reaktive kjemiske grupper i proteiner1,2.
MmAcKRS1 ble utviklet fra Methanosarcina mazei PylRS og ofte brukt i vårt laboratorium for syntese av acetylerte proteiner3,4,5,6. MmAcKRS1 leverer AcK på et gult mutasjonssted i mRNA etter eget valg under oversettelse i Escherichia coli. Denne teknikken har tidligere blitt brukt til å inkorporere AcK på K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 og K79 histone H3 lysin nettsteder for å studere aktiviteten til Sirtuin 1, 2, 6 og 7 på acetylerte mononukleosomer4,5,6. Her beskriver vi denne metoden for å uttrykke acetylerte histoner og rekonstituere acetylerte nukleosomer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er viktig å følge denne protokollen i alle detaljer under et eksperiment. Nukleosomer er ikke veldig stabile, og mye prøving og feiling har gått med til å bestemme denne protokollen. Det er viktig å fjerne utfellinger på hvert trinn (eller når de observeres) fordi partikler lett kan forstyrre monteringsprosessene. Hold alltid histoneprøver på is. Hvis nukleosomer lagres ved 4 °C for lenge, kan de spontant demonteres. Sørg for å sjekke eventuelle prøver fra Native PAGE hvis de oppbevares ved 4 °C i mer …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil takke Dr. Wesley Wang for at han la grunnlaget for denne protokollen og hans verdifulle mentorskap. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (Grants R01GM127575 og R01GM121584) og Welch Foundation (Grant A-1715).
Materials
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
Riferimenti
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2′-5′-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2′,5′)pA(3′,5′)p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
