שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב Arabidopsis

Summary

איתות סידן מערכתי המופעל על ידי גלוטמט חוץ-תאי הוא קריטי לגיוס תגובות הגנת הצמח לפצעים מכניים ולתקפת אוכלי עשב בצמחים. מאמר זה מתאר שיטה לדמיין את הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של שני גורמים אלה באמצעות צמחי תאליאנה ערבידופסיס המבטאים ביוסנסורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן וגלוטמט.

Abstract

צמחים מגיבים ללחצים מכניים כגון פצעים ואוכלי עשב על ידי גרימת תגובות הגנה הן בחלקים הפגועים והן בחלקים הלא פגומים. עם פציעת עלה, מתרחשת עלייה בריכוז יון הסידן הציטוזולי (Ca²⁺ אות) באתר הפצע. אות זה מועבר במהירות לעלים לא פגומים, שם מופעלות תגובות ההגנה. המחקר האחרון שלנו גילה כי גלוטמט דולף מהתאים הפצועים של העלה לתוך apoplast סביבם משמש אות פצע. גלוטמט זה מפעיל ערוצים חדירים דמויי קולטן גלוטמט Ca²⁺ , מה שמוביל להפצת אותות Ca²⁺ למרחקים ארוכים ברחבי הצמח. המאפיינים המרחביים והטמפורליים של אירועים אלה ניתן ללכוד עם הדמיה בזמן אמת של צמחים חיים המבטאים biosensors פלואורסצנטי מקודד גנטית. כאן אנו מציגים שיטת הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת כדי לנטר את הדינמיקה של אותות Ca²⁺ ושינויים בגלוטמט אפופלסטי המתרחשים בתגובה לפציעה. גישה זו משתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה ובצמחי Arabidopsis מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המבוסס על Ca²⁺ וביו-סנסורים גלוטמטים. בנוסף, אנו מציגים מתודולוגיה כדי לעורר בקלות פצע-induced, גלוטמט מופעלות מהירות למרחקים ארוכים Ca^{2 +} התפשטות אות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על מחקרים על לחצים צמחיים אחרים כדי לעזור לחקור כיצד איתות מערכתי צמח עשוי להיות מעורב ברשתות האיתות והתגובה שלהם.

Introduction

צמחים אינם יכולים לברוח מלחצים ביוטיים, למשל, חרקים הניזונים מהם, ולכן הם פיתחו חישת מתח מתוחכמת ומערכות העברת אותות כדי לזהות ואז להגן על עצמם מפני אתגרים כגון אוכלי עשב¹. עם פציעה או התקפת אוכלי עשב, צמחים ליזום תגובות הגנה מהירה כולל הצטברות של חומצה ג’אסמונית phytohormone (JA) לא רק באתר הפצוע, אלא גם באיברים דיסטליים ניזוק². JA זה אז הן מפעילה תגובות הגנה ברקמות שנפגעו ישירות וגורם מראש הגנות בחלקים ניזוקו של הצמח. ב Arabidopsis, הצטברות של JA הנגרמת על ידי פציעה זוהתה עלים דיסטליים, שלמים בתוך דקות ספורות של נזק במקומות אחרים במפעל מציע כי אות מהיר למרחקים ארוכים מועבר מן העלה הפצוע³. מספר מועמדים, כגון Ca^{2 +}, מינים חמצן תגובתי (ROS), ואותות חשמליים, הוצעו לשמש אותם פצע למרחקים ארוכים אלה בצמחים^4,5.

Ca²⁺ הוא אחד האלמנטים המגוונים ביותר בכל מקום שליח שני באורגניזמים אוקריוטיים. בצמחים, לעיסת זחל ופציעה מכנית גורמים לעלייה דרסטית בריכוז ציטוזולי Ca²⁺ ([Ca²⁺]_ציט)הן בעל הפצוע והן בעלים מרוחקים לא מבוססים^6,7. אות Ca²⁺ מערכתי זה מתקבל על ידי חלבונים תאיים Ca²⁺חישה, אשר מובילים להפעלת מסלולי איתות הגנה במורד הזרם, כולל JA biosynthesis^8,9. למרות דיווחים רבים כאלה התומכים בחשיבות של Ca^{2 +} אותות בתגובות פצע הצמח, מידע על המאפיינים המרחביים והטמפורליים של Ca^{2 +} אותות הנגרמים על ידי פציעה מוגבל.

הדמיה בזמן אמת באמצעות מחווני Ca²⁺ מקודדים גנטית היא כלי רב עוצמה לניטור וכימות הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של אותות Ca²⁺ . עד כה פותחו גרסאות של חיישנים כאלה המאפשרות הדמיה של אותות Ca²⁺ ברמה של תא יחיד, לרקמות, איברים ואפילו צמחים שלמים¹⁰. הביוסנסור הראשון המקודד גנטית עבור Ca²⁺ המשמש בצמחים היה אקוורין החלבון הביולומינסנטי המופק ממדוזה Aequorea victoria¹¹. למרות חלבון chemiluminescent זה שימש כדי לזהות Ca^{2 +} שינויים בתגובה לחצים שונים בצמחים^{12,13,14,15,16,17,18}, זה לא מתאים היטב עבור הדמיה בזמן אמת בשל אות זוהר נמוך מאוד שהיא מייצרת. Förster תהודה העברת אנרגיה (FRET)מבוסס Ca^{2 +} אינדיקטורים, כגון הגמלים הצהובים, שימשו גם בהצלחה כדי לחקור את הדינמיקה של מגוון של Ca^{2 +} אירועי איתות במפעלים^{19,20,21,22,23,24}. חיישנים אלה תואמים לגישות הדמיה ובדרך כלל מורכבים מ- Ca^{2 +} חלבון מחייב calmodulin (CaM) ופפטיד מחייב CaM (M13) מתוך קינאז שרשרת אור מיוסין, כל התמזגו בין שני חלבוני פלואורופור, בדרך כלל חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וגרסה חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP)¹⁰. Ca²⁺ מחייב CaM מקדם את האינטראקציה בין CaM ו M13 המוביל לשינוי קונפורמציה של החיישן. שינוי זה מקדם העברת אנרגיה בין CFP ו- YFP, אשר מגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות של YFP תוך הפחתת פליטת הפלואורסצנטיות מן CFP. ניטור מעבר זה מ- CFP לפלואורסצנטיות YFP מספק מדד לעלייה ברמת Ca²⁺ . בנוסף לחיישני FRET אלה, חלבון פלואורסצנטי יחיד (FP)מבוסס Ca²⁺ biosensors, כגון GCaMP ו- R-GECO, תואמים גם הם לגישות הדמיה צמחית ומשמשים באופן נרחב לחקר [Ca²⁺] שינויים_בציט בשל הרגישות הגבוהה שלהם וקלות השימוש^{25,26,27,28,29,30}. GCaMPs מכילים GFP יחיד שעבר מוטציה מעגלית (cp), שוב התמזגו עם CaM ופפטיד M13. האינטראקציה התלויה ב- Ca²⁺בין CaM ל- M13 גורמת לשינוי קונפורמי בחיישן המקדם שינוי במצב הפרוטונציה של cpGFP, ומשפר את אות הפלואורסצנטי שלו. לכן, כמו Ca^{2 +} רמות עלייה, אות cpGFP עולה.

כדי לחקור את הדינמיקה של Ca^{2 +} אותות שנוצרו בתגובה לפצעים מכניים או האכלת אוכלי עשב, השתמשנו בצמחי תלתנא ערבידופסיס מהונדסים המבטאים גרסה GCaMP, GCaMP3, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב⁶. גישה זו הצליחה לדמיין העברה מהירה של אות Ca²⁺ למרחקים ארוכים מאתר הפצע על עלה לצמח כולו. לכן, עלייה [Ca²⁺]_ציט זוהה מיד באתר הפצע אבל זה Ca^{2 +} אות הופץ אז לעלים השכנים דרך כלי הדם בתוך כמה דקות של פציעה. יתר על כן, מצאנו כי העברת אות הפצע המערכתי המהיר הזה מבוטלת בצמחי Arabidopsis עם מוטציות בשני גנים דמויי קולטן גלוטמט, קולטן גלוטמט כמו (GLR), GLR3.3, ו GLR3.6⁶. GLRs מופיעים לתפקד כמו חומצת אמינו מגודר Ca^{2 +} ערוצי מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים מגוונים, כולל תגובת פצע³, צמיחת צינור אבקה³¹, פיתוח שורש³², תגובה קרה³³, וחסינות מולדת³⁴. למרות פונקציה פיזיולוגית רחבה ומובנה זו של GLRs, מידע על המאפיינים הפונקציונליים שלהם, כגון הספציפיות שלהם ליגנד, סלקטיביות היונים, לוקליזציה תת תאית, מוגבלים³⁵. עם זאת, מחקרים אחרונים דיווחו כי GLR3.3 ו GLR3.6 הם מקומיים פלום ו xylem, בהתאמה. ל- GLRs של צמחים יש קווי דמיון לקולטני גלוטמט יונוטרופיים (iGluRs)³⁶ ביונקים, המופעלים על ידי חומצות אמינו, כגון גלוטמט, גליצין ו- D-serine במערכת העצבים של היונקים³⁷. אכן, הוכחנו כי היישום של גלוטמט 100 מ”מ, אבל לא חומצות אמינו אחרות, באתר הפצע גורם מהיר, למרחקים ארוכים Ca^{2 +} אות Arabidopsis, המציין כי גלוטמט חוץ תאיים סביר פועל כאות פצע בצמחים⁶. תגובה זו מבוטלת glr3.3/glr3.6 מוטנט מציע כי גלוטמט עשוי לפעול דרך אחד או שניהם של ערוצים אלה דמויי קולטן ואכן, AtGLR3.6 הוכח לאחרונה להיות מגודר על ידי רמות אלה של גלוטמט³⁸.

בצמחים, בנוסף לתפקידו כחומצת אמינו מבנית, גלוטמט הוצע גם כרגולטור התפתחותי מרכזי³⁹; עם זאת, הדינמיקה המרחבית והטמפורלית שלו מובנת היטב. בדיוק כמו Ca^{2 +}, מספר אינדיקטורים מקודדים גנטית גלוטמט פותחו כדי לפקח על הדינמיקה של חומצת אמינו זו בתאים^{חיים 40,41}. iGluSnFR הוא ביו-סנסור גלוטמט יחיד מבוסס GFP המורכב מ- cpGFP וחלבון מחייב גלוטמט (GltI) מ Escherichia coli^42,43. השינוי הקונפורמי של iGluSnFR, המושרה על ידי גלוטמט מחייב GltI, תוצאות פליטת פלואורסצנטיות GFP משופרת. כדי לחקור אם גלוטמט חוץ-תאי פועל כמולקולה איתות בתגובת פצע הצמח, חיברנו את רצף iGluSnFR עם רצף הפרשת פפטיד אות chitinase בסיסי (CHIB-iGluSnFR) כדי להתאים את biosensor זה בחלל האפופלסטיק⁶. גישה זו אפשרה הדמיה של כל שינוי בריכוז הגלוטמט האפופלוסי ([Glu]_apo) באמצעות צמחי Arabidopsis מהונדסים המבטאים חיישן זה. גילינו עליות מהירות באות iGluSnFR באתר הפציעה. נתונים אלה תומכים ברעיון כי גלוטמט דולף מתוך התאים הפגועים / רקמות כדי apoplast על הפציעה ופועל כאות נזק הפעלת GLRs ומוביל למרחקים ארוכים Ca^{2 +} אות בצמחים⁶.

כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת באמצעות biosensors מקודדים גנטית כדי לפקח ולנתח את הדינמיקה של Ca²⁺ למרחקים ארוכים אותות גלוטמט חוץ תאיים בתגובה לפציעה⁶. הזמינות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה וצמחים מהונדסים המבטאים ביו-סנסורים מקודדים גנטית מספקת גישה רבת עוצמה אך מיושמת בקלות לזיהוי אותות למרחקים ארוכים המועברים במהירות, כגון גלי Ca²⁺ .

Protocol

1. הכנת חומר צמחי במיקרו-צינורית של 1.5 מ”ל, פני השטח מעקרים את הזרעים של הצמח Arabidopsis thaliana (הצטרפות קול-0) המבטאים GCaMP3 או CHIB-iGluSnFR על ידי טלטול עם 20% (v /v) NaClO במשך 3 דקות ולאחר מכן לשטוף 5 פעמים עם מים מזוקקים סטריליים.הערה: הקווים המהונדסים של Arabidopsis המבטא GCaMP3 או CHIB-iGluSnFR תוארו בעבר<sup …

Representative Results

הפצת אותות של [Ca2+]ct ו- [Glu]apo בתגובה לפציעה מוצגת באיור 3, איור 4, סרט S1וסרט S2. חיתוך פטיולה של העלה 1 בצמחים המבטאים GCaMP3 (ב 0 s) הוביל לעלייה משמעותית [Ca2+]ציט כי היה במהירות המושרה באופן מקומי דרך כל?…

Discussion

איתות מערכתי חשוב לצמחים להגיב לגירויים סביבתיים חיצוניים מקומיים ולאחר מכן לשמור על הומאוסטזיס שלהם ברמת צמח שלמה. למרות שהם אינם מצוידים במערכת עצבים מתקדמת כמו בעלי חיים, הם משתמשים בתקשורת מהירה הן בתוך ובין איברים המבוססים על גורמים כגון אותות חשמליים ניידים (ואולי הידראוליים) וגלי?…

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16