श्वसन वायरस संक्रमण के दौरान जन्मजात प्रतिरक्षा सेल सक्रियण के अध्ययन के लिए संपर्क-मुक्त सह-संस्कृति मॉडल
Summary
यह प्रोटोकॉल वायरल रूप से संक्रमित नाक उपकला कोशिकाओं और जन्मजात सेल सक्रियण के बीच शुरुआती बातचीत की जांच का विवरण देता है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं के व्यक्तिगत सबसेट को वायरल संक्रमण के जवाब में उनके सक्रियण के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है। फिर उन्हें शुरुआती एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं पर उनके प्रभावों को निर्धारित करने के लिए आगे की जांच की जा सकती है।
Abstract
वायरल संक्रमण के दौरान नाक की उपकला परत और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच प्रारंभिक बातचीत एक अंडर-एक्सप्लोर्ड क्षेत्र बनी हुई है। वायरल संक्रमण में जन्मजात प्रतिरक्षा सिग्नलिंग का महत्व काफी बढ़ गया है क्योंकि श्वसन संक्रमण वाले रोगी जो उच्च जन्मजात टी सेल सक्रियण प्रदर्शित करते हैं, एक बेहतर बीमारी परिणाम दिखाते हैं। इसलिए, इन शुरुआती जन्मजात प्रतिरक्षा इंटरैक्शन को विच्छेदन करने से उन प्रक्रियाओं की व्याख्या की अनुमति मिलती है जो उन्हें नियंत्रित करते हैं और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों और रणनीतियों के विकास को कम करने या यहां तक कि वायरल संक्रमण की शुरुआती प्रगति को रोकने के लिए सुविधाजनक बना सकते हैं। यह प्रोटोकॉल एक बहुमुखी मॉडल का विवरण देता है जिसका उपयोग वायरल रूप से संक्रमित वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं द्वारा स्रावित कारकों से जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के शुरुआती क्रॉसस्टॉक, इंटरैक्शन और सक्रियण का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। प्रतिनिधि वायरस मॉडल के रूप में एक H3N2 इन्फ्लूएंजा वायरस (A/Aichi/2/1968) का उपयोग करते हुए, सह-सुसंस्कृत परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) के जन्मजात सेल सक्रियण का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके किया गया है ताकि कोशिकाओं के सबसेट की जांच की जा सके जो वायरल संक्रमण के जवाब में उपकला से जारी घुलनशील कारकों द्वारा सक्रिय होते हैं। परिणाम कोशिकाओं के सबसेट को अलग करने के लिए गेटिंग रणनीति का प्रदर्शन करते हैं और पीबीएमसी की सक्रिय आबादी और नियंत्रण और संक्रमित उपकला के साथ उनके क्रॉसस्टॉक के बीच स्पष्ट अंतर को प्रकट करते हैं। सक्रिय सबसेट को तब उनके कार्यों के साथ-साथ कोशिकाओं के लिए विशिष्ट आणविक परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए आगे विश्लेषण किया जा सकता है। इस तरह के एक crosstalk जांच से निष्कर्ष उन कारकों को उजागर कर सकते हैं जो महत्वपूर्ण जन्मजात सेल आबादी के सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो वायरल संक्रमण की प्रगति को नियंत्रित करने और दबाने में फायदेमंद हैं। इसके अलावा, इन कारकों को सार्वभौमिक रूप से विभिन्न वायरल बीमारियों पर लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से नए उभरते वायरस के लिए, ऐसे वायरस के प्रभाव को कम करने के लिए जब वे पहली बार भोले मानव आबादी में प्रसारित होते हैं।
Introduction
श्वसन वायरस शायद सबसे व्यापक रोगजनकों में से एक हैं जो गंभीर स्वास्थ्य देखभाल और आर्थिक बोझ का कारण बनते हैं। उभरते हुए महामारी उपभेदों (जैसे, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) के आवधिक वैश्विक प्रकोपों से लेकर हर साल इन्फ्लूएंजा के मौसमी उपभेदों तक, वायरस सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक निरंतर खतरा हैं। यद्यपि टीके इन वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य चुनौतियों की प्रतिक्रिया का मुख्य थोक बनाते हैं, यह ध्यान रखना गंभीर है कि ये countermeasures केवल उत्तरदायी 1,2 हैं। इसके अलावा, एक नए संक्रामक तनाव के उद्भव और इसके टीके के सफल विकास के बीचदेरी अपरिहार्य है, जिससे एक ऐसी अवधि होती है जब वायरस के प्रसार को रोकने के लिए उपलब्ध उपाय अत्यधिक सीमित होते हैं।
इन देरी को आगे उन लागतों द्वारा जोर दिया जाता है जो समाज-आर्थिक और सामाजिक रूप से लगाए जाते हैं। अकेले मौसमी फ्लू अप्रत्यक्ष लागत में लगभग $ 8 बिलियन, चिकित्सा लागत में $ 3.2 बिलियन, और संयुक्त राज्य अमेरिका में सालाना 36.3 हजार मौतों के लिए जिम्मेदारहै। यह अनुसंधान लागतों पर विचार करने से पहले है जो वैक्सीन के विकास को निधि देने के लिए आवश्यक हैं। महामारी के प्रकोप का समाज पर और भी गंभीर प्रभाव पड़ता है, जो हर साल वैश्वीकरण की बढ़ती दर से जटिल होता है, जैसा कि गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम के उद्भव और तेजी से प्रसार के कारण वैश्विक व्यवधानों से स्पष्ट है कोरोनोवायरस 2 (सार्स-कोव -2) 5,6,7।
हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सक्रिय जन्मजात टी कोशिकाओं की अधिक आबादी वाले संक्रमित रोगियों में बेहतर बीमारी का परिणाम 8,9,10 होता है। इसके अलावा, जन्मजात टी सेल जनसंख्या को कई उपसमूहों में वर्गीकृत किया गया है: म्यूकोसल-संबद्ध अपरिवर्तनीय टी (एमएआईटी) कोशिकाएं, Vπ1π t कोशिकाएं, Vπ2π t कोशिकाएं, और प्राकृतिक हत्यारा T (NKT) कोशिकाएं। जन्मजात टी कोशिकाओं के ये उपसमूह भी अपनी आबादी के भीतर विषमता प्रदर्शित करते हैं, जिससे जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल सेल आबादी के बीच बातचीत की जटिलताबढ़ जाती है। इसलिए, तंत्र जो इन जन्मजात टी कोशिकाओं को सक्रिय करता है और जन्मजात टी कोशिकाओं के विशिष्ट उपसमूहों का ज्ञान मानव मेजबान पर इन वायरसों के संक्रामक प्रभावों को कम करने के लिए अनुसंधान का एक अलग एवेन्यू प्रदान कर सकता है, खासकर वैक्सीन विकास की अवधि के दौरान।
इन्फ्लूएंजा से संक्रमित उपकला कोशिकाएं उन कारकों का उत्पादन करती हैं जो जन्मजात टी कोशिकाओं को तेजी सेसक्रिय करती हैं 12,13,14। उस खोज पर निर्माण, इस संपर्क-मुक्त एयर-लिक्विड इंटरफेस (एएलआई) सह-संस्कृति मॉडल का उद्देश्य प्रारंभिक संक्रमण के दौरान संक्रमित नाक उपकला परत और पीबीएमसी के बीच प्रारंभिक रासायनिक इंटरैक्शन (संक्रमित उपकला परत द्वारा जारी घुलनशील कारकों द्वारा मध्यस्थता) की नकल करना है। नाक उपकला परत (झिल्ली आवेषण पर सुसंस्कृत) और PBMCs (नीचे कक्ष में) और उपकला अखंडता के बीच शारीरिक अलगाव वायरस द्वारा PBMCs के प्रत्यक्ष संक्रमण को रोकता है, जिससे PBMCs पर उपकला-व्युत्पन्न घुलनशील कारकों के प्रभावों का एक विस्तृत अध्ययन किया जा सकता है। इसलिए पहचाने गए कारकों को उचित जन्मजात टी सेल आबादी को प्रेरित करने में उनकी चिकित्सीय क्षमता के लिए आगे की जांच की जा सकती है जो इन्फ्लूएंजा संक्रमण से रक्षा कर सकते हैं। इसलिए इस पेपर ने उपकला-व्युत्पन्न घुलनशील कारकों से जन्मजात टी-सेल सक्रियण के अध्ययन के लिए एक सह-संस्कृति स्थापित करने के तरीकों को विस्तृत किया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वायरस के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं एंटीवायरल प्रबंधन में अध्ययन का एक अंडर-जांच क्षेत्र हैं। वायुमार्ग उपकला कोशिकाएं और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं एक संक्रमण के दौरान वायरल प्रतिक…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एनयूएस डिपार्टमेंट ऑफ ओटोलरींगोलॉजी और माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी विभाग में अनुसंधान कर्मचारियों को एचएनईसी संस्कृति और वायरल-संस्कृति से संबंधित काम के साथ उनकी मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम नेशनल यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल, ओटोलरींगोलॉजी विभाग में सर्जनों और सर्जिकल टीम को भी धन्यवाद देना चाहते हैं, जो अध्ययन के लिए आवश्यक कोशिका और रक्त के नमूने प्रदान करने में उनकी सहायता के लिए हैं।
इस अध्ययन को राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद, सिंगापुर सं 2009 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एनएमआरसी / सीआईआरजी / 1458 / 2016 (डी यून वांग के लिए) और एमओएच-ओएफआईआरजी 19 मई -0007 (काई सेन टैन के लिए)। काई सेन टैन यूरोपीय एलर्जी और नैदानिक इम्यूनोलॉजी (EAACI) रिसर्च फैलोशिप 2019 से फैलोशिप समर्थन का एक प्राप्तकर्ता है।
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 | |
Riferimenti
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