Modello di co-coltura senza contatto per lo studio dell'attivazione delle cellule immunitarie innate durante l'infezione da virus respiratorio
Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio un’indagine sulle prime interazioni tra cellule epiteliali nasali infettate viralmente e attivazione cellulare innata. I singoli sottoinsiemi di cellule immunitarie possono essere distinti in base alla loro attivazione in risposta alle infezioni virali. Possono quindi essere ulteriormente studiati per determinare i loro effetti sulle prime risposte antivirali.
Abstract
Le prime interazioni tra lo strato epiteliale nasale e le cellule immunitarie innate durante le infezioni virali rimangono un’area poco esplorata. Il significato della segnalazione dell’immunità innata nelle infezioni virali è aumentato sostanzialmente poiché i pazienti con infezioni respiratorie che mostrano un’elevata attivazione innata delle cellule T mostrano un esito migliore della malattia. Quindi, sezionare queste prime interazioni immunitarie innate consente di chiarire i processi che le governano e può facilitare lo sviluppo di potenziali bersagli terapeutici e strategie per smorzare o addirittura prevenire la progressione precoce delle infezioni virali. Questo protocollo descrive un modello versatile che può essere utilizzato per studiare la diafonia precoce, le interazioni e l’attivazione delle cellule immunitarie innate da fattori secreti da cellule epiteliali delle vie aeree infettate viralmente. Utilizzando un virus influenzale H3N2 (A/Aichi/2/1968) come modello di virus rappresentativo, l’attivazione cellulare innata delle cellule mononucleate del sangue periferico co-coltivate (PBMC) è stata analizzata utilizzando la citometria a flusso per studiare i sottoinsiemi di cellule che vengono attivate dai fattori solubili rilasciati dall’epitelio in risposta all’infezione virale. I risultati dimostrano la strategia di gating per differenziare i sottoinsiemi di cellule e rivelano le chiare differenze tra le popolazioni attivate di PBMC e il loro crosstalk con il controllo e l’epitelio infetto. I sottoinsiemi attivati possono quindi essere ulteriormente analizzati per determinare le loro funzioni e i cambiamenti molecolari specifici delle cellule. I risultati di tale indagine crosstalk possono scoprire fattori importanti per l’attivazione di popolazioni cellulari innate vitali, che sono utili nel controllare e sopprimere la progressione dell’infezione virale. Inoltre, questi fattori possono essere universalmente applicati a diverse malattie virali, in particolare ai virus emergenti di recente, per smorzare l’impatto di tali virus quando circolano per la prima volta in popolazioni umane ingenue.
Introduction
I virus respiratori sono forse tra i patogeni più diffusi che causano gravi oneri sanitari ed economici. Dai periodici focolai globali di ceppi epidemici emergenti (ad esempio, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ai ceppi stagionali di influenza ogni anno, i virus sono una minaccia costante per la salute pubblica. Sebbene i vaccini costituiscano la maggior parte della risposta a queste sfide globali per la salute pubblica, fa riflettere notare che queste contromisure sono semplicemente reattive 1,2. Inoltre, un ritardo tra l’emergere di un nuovo ceppo infettivo e il successo dello sviluppo del suo vaccino è inevitabile3, portando a un periodo in cui le misure disponibili per frenare la diffusione del virus sono altamente limitate.
Questi ritardi sono ulteriormente enfatizzati dai costi che vengono inflitti alla società, economicamente e socialmente. L’influenza stagionale da sola è responsabile di circa 8 miliardi di dollari di costi indiretti, 3,2 miliardi di dollari di spese mediche e 36,3 mila morti negli Stati Uniti d’America ogni anno4. Questo prima di considerare i costi di ricerca necessari per finanziare lo sviluppo del vaccino. Le epidemie hanno effetti ancora più gravi sulla società, aggravati dal crescente tasso di globalizzazione ogni anno, come evidenziato dalle interruzioni globali causate dall’emergere e dalla rapida diffusione del coronovirus della sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Studi recenti hanno dimostrato che i pazienti infetti che hanno una maggiore popolazione di cellule T innate attivate tendono ad avere un esito migliore della malattia 8,9,10. Inoltre, la popolazione innata di cellule T è classificata in più sottogruppi: le cellule T invarianti associate alla mucosa (MAIT), le cellule T Vδ1 γδ, le cellule T Vδ2 γδ e le cellule T natural killer (NKT). Questi sottogruppi di cellule T innate mostrano anche eterogeneità all’interno delle loro popolazioni, aumentando la complessità delle interazioni tra le popolazioni cellulari coinvolte nella risposta immunitaria innata11. Quindi, il meccanismo che attiva queste cellule T innate e la conoscenza dei sottogruppi specifici di cellule T innate possono fornire una diversa via di ricerca per ridurre gli effetti infettivi di questi virus sull’ospite umano, specialmente durante il periodo di sviluppo del vaccino.
Le cellule epiteliali infettate dall’influenza producono fattori che attivano rapidamente le cellule T innate 12,13,14. Basandosi su questa scoperta, questo modello di co-coltura Air-Liquid Interface (ALI) senza contatto mira a imitare le prime interazioni chimiche (mediate da fattori solubili rilasciati dallo strato epiteliale infetto) tra lo strato epiteliale nasale infetto e le PBMC durante l’infezione precoce. La separazione fisica tra lo strato epiteliale nasale (coltivato su inserti di membrana) e le PBMC (nella camera sottostante) e l’integrità epiteliale prevengono l’infezione diretta delle PBMC da parte del virus, consentendo uno studio dettagliato degli effetti dei fattori solubili derivati dall’epitelio sulle PBMC. I fattori identificati possono quindi essere ulteriormente studiati per il loro potenziale terapeutico nell’indurre l’appropriata popolazione di cellule T innate che possono proteggere dall’infezione influenzale. Questo documento ha quindi dettagliato i metodi per stabilire una co-coltura per lo studio dell’attivazione innata delle cellule T da fattori solubili derivati dall’epitelio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le risposte immunitarie innate contro i virus sono un campo di studio poco studiato nella gestione antivirale. Le cellule epiteliali delle vie aeree e le cellule immunitarie innate lavorano di concerto per sopprimere la replicazione virale durante un’infezione, oltre a servire come determinante della risposta adattativa iperattiva se la carica virale non viene tenuta sotto controllo 12,13,17. Tuttavia, lo sviluppo di un modello …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il personale di ricerca del Dipartimento di Otorinolaringoiatria della NUS e del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia per il loro aiuto con il lavoro relativo alla cultura hNEC e alla cultura virale. Vorremmo anche ringraziare i chirurghi e il team chirurgico del National University Hospital, Dipartimento di Otorinolaringoiatria, per la loro assistenza nel fornire i campioni di cellule e sangue necessari per lo studio.
Questo studio è stato finanziato dal National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (a De Yun Wang) e MOH-OFYIRG19may-0007 (a Kai Sen Tan). Kai Sen Tan ha ricevuto una borsa di studio sostenuta dalla European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 | |
Riferimenti
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