Questo metodo introduce una semplice tecnica per il rilevamento del rilascio endogeno di monoammina utilizzando fette di cervello acute. La configurazione utilizza una piastra a 48 pozzetti contenente un supporto in tessuto per il rilascio di monoammina. La monoammina rilasciata viene analizzata mediante HPLC accoppiato con il rilevamento elettrochimico. Inoltre, questa tecnica fornisce un metodo di screening per la scoperta di farmaci.
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Articolo metodologico
Un test basato su piastre per la misurazione del rilascio di monoamina endogena in fette cerebrali acute
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I neurotrasmettitori monoamminici sono associati a numerosi disturbi neurologici e psichiatrici. Modelli animali di tali condizioni hanno mostrato alterazioni nel rilascio di neurotrasmettitori monoamminici e nelle dinamiche di assorbimento. Metodi tecnicamente complessi come l'elettrofisiologia, la voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV), l'imaging, la microdialisi in vivo, l'optogenetica o l'uso della radioattività sono necessari per studiare la funzione della monoammina. Il metodo qui presentato è un approccio ottimizzato in due fasi per rilevare il rilascio di monoammina in fette cerebrali acute utilizzando una piastra a 48 pozzetti contenente supporti tissutali per esaminare il rilascio di monoammina e cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con rilevamento elettrochimico (HPLC-ECD) per la misurazione del rilascio di monoammina. In breve, le sezioni cerebrali di ratto contenenti regioni di interesse, tra cui la corteccia prefrontale, l'ippocampo e lo striato dorsale sono state ottenute utilizzando un'affettatrice di tessuto o vibratoma. Queste regioni di interesse sono state sezionate da tutto il cervello e incubate in un tampone fisiologico ossigenato. La vitalità è stata esaminata durante il corso del tempo sperimentale, mediante il test 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT). Le regioni cerebrali acutamente sezionate sono state incubate in diverse condizioni farmacologiche che sono note per indurre il rilascio di monoammina attraverso il trasportatore (anfetamina) o attraverso l'attivazione del rilascio vescicolare esocitotico (KCl). Dopo l'incubazione, i prodotti rilasciati nel surnatante sono stati raccolti e analizzati attraverso un sistema HPLC-ECD. Qui, il rilascio basale di monoammina viene rilevato dall'HPLC da fette di cervello acute. Questi dati supportano i precedenti risultati in vivo e in vitro che mostrano che AMPH e KCl inducono il rilascio di monoammina. Questo metodo è particolarmente utile per studiare i meccanismi associati al rilascio dipendente dal trasportatore di monoammine e offre l'opportunità di esaminare i composti che influenzano il rilascio di monoammina in modo rapido e a basso costo.
Introduzione
Una pletora di malattie neurologiche e psichiatriche sono associate a disregolazione o insufficiente mantenimento del neurotrasmettitore monoamminico (dopamina [DA], serotonina [5-HT], noradrenalina [NE]) omeostasi1,2,3. Queste condizioni includono, ma non sono limitate a, depressione1,2, schizofrenia2, ansia2, dipendenza4, menopausa5,6,7, dolore8<....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti, compresa la manipolazione degli animali e la raccolta dei tessuti, sono stati condotti in conformità con l'Università della Florida e il City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), seguendo il protocollo approvato 201508873 (UF) e 1071 (CCNY). Per i reagenti e il tampone, fare riferimento al file supplementare.
1. Preparare fette di cervello di ratto acuto
NOTA: In questo esperimento sono stati utilizzati ratti maschi adulti (250-350 g). Tuttavia, questa configurazione è funzionale per diversi punti di sviluppo, ratti femmina e altre specie. ....
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Risultati
Questa tecnica descrive l'uso di fette di cervello per misurare il rilascio di monoammine endogene utilizzando HPLC con rilevamento elettrochimico basato su una piastra a 48 pozzetti con un supporto tissutale interno. L'impostazione sperimentale è illustrata nella Figura 1 e nella Figura 2. Inizialmente, per garantire la vitalità dei tessuti entro la fine della sperimentazione, è stato eseguito un test MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2.......
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Discussione
Le misurazioni del rilascio di monoammine sono state eseguite per anni in un certo numero di sistemi come cellule eterologhe, colture neuronali, sinaptosomi cerebrali, fette di cervello acute ex vivo e animali interi13,20,41,42,58,64,65,66,67,68<.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni Fondecyt Initiation Fund N 11191049 a J.A.P. e dalla sovvenzione NIH DA038598 a G.E.T.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra a 48 pozzetti | NA | NA Saggio | |
| Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Fase mobile |
| Cloruro di calcio Aidro | Sigma Aldrich | C1016 | Liquido cerebrospinale artificiale modificato O Tampone di efflusso |
| Software di chiarezza | Anetc | ||
| Acido citrico | Sigma Aldrich | Fase mobile | |
| D-(+)-glucosio | Sigma | 1002608421 | tampone di dissezione |
| DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
| EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| GraphPad Software Graphpad | Software, Inc | Analisi statistica | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Tampone di lisi |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Tampone di lisi |
| HPLC, Decade Amperometrico | Anetc | HPLC, sistema LC-EC | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
| Acido L-Asrobico | Sigma Aldrich | A5960 | Tampone di dissezione |
| Solfato di magnesio | Sigma | 7487-88-9 | KH Unità |
| filtranti per microcentrifuga | tampone UltraFree Millipore | C7554 | Saggio - 6 per adattarsi alla piastra a 48 pozzetti |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | Saggio |
| MTT Nanosep | VWR | 29300-606 | saggio delle proteine |
| Acido ottantasolfonico | Sigma Aldrich | V800010 | Fase mobile |
| Pargyline Cloroidrato | Sigma Aldrich | P8013 | Liquido cerebrospinale artificiale modificato O tampone di efflusso |
| Acido fosforico | Sigma Aldrich | Cloruro | |
| Sigma | 12636 | KH Tampone | |
| fosfato di potassio monobasico | Sigma | 1001655559 | KH |
| Tampone Precisonario VF-21-0Z | Compressoma | precissonario | |
| Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Tampone di lisi. |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | S5761 | Tampone di dissezione |
| Bicarbonato di sodio | Sigma Aldrich | S5761 | Tampone di dissezione |
| Cloruro di sodio | Sigma | S3014 | KH Tampone |
| Dodecil solfato di sodio | Sigma | Aldrich L3771 | Tampone di lisi |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Saggio / Tampone di lisi |
Riferimenti
- Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
- Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S.
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Ristampe e permessi
