Explantes de tumores derivados de pacientes como una plataforma preclínica "viva" para predecir la resistencia a los medicamentos en pacientes
Summary
Este artículo describe métodos para la generación, el tratamiento farmacológico y el análisis de explantes derivados del paciente para evaluar las respuestas a los medicamentos tumorales en un sistema modelo preclínico vivo, relevante para el paciente.
Abstract
La comprensión de la resistencia a los medicamentos y el desarrollo de nuevas estrategias para sensibilizar a los cánceres altamente resistentes dependen de la disponibilidad de modelos preclínicos adecuados que puedan predecir con precisión las respuestas de los pacientes. Una de las desventajas de los modelos preclínicos existentes es la incapacidad de preservar contextualmente el microambiente tumoral humano (EMT) y representar con precisión la heterogeneidad intratumoral, limitando así la traducción clínica de los datos. Por el contrario, al representar el cultivo de fragmentos vivos de tumores humanos, la plataforma de explante derivado del paciente (PDE) permite examinar las respuestas a los medicamentos en un contexto tridimensional (3D) que refleja las características patológicas y arquitectónicas de los tumores originales lo más cerca posible. Informes previos con PDE han documentado la capacidad de la plataforma para distinguir tumores quimiosensibles de los quimiorresistentes, y se ha demostrado que esta segregación es predictiva de las respuestas de los pacientes a las mismas quimioterapias. Simultáneamente, las PDE permiten la oportunidad de interrogar las características moleculares, genéticas e histológicas de los tumores que predicen las respuestas a los medicamentos, identificando así biomarcadores para la estratificación del paciente, así como nuevos enfoques intervencionistas para sensibilizar a los tumores resistentes. Este documento informa sobre la metodología PDE en detalle, desde la recolección de muestras de pacientes hasta el análisis de punto final. Proporciona una descripción detallada de la derivación de explantes y los métodos de cultivo, destacando las condiciones a medida para tumores particulares, cuando corresponda. Para el análisis de endpoints, hay un enfoque en la inmunofluorescencia multiplexada y las imágenes multiespectrales para el perfil espacial de biomarcadores clave dentro de las regiones tumorales y estromales. Al combinar estos métodos, es posible generar datos cuantitativos y cualitativos de respuesta a los medicamentos que pueden relacionarse con diversos parámetros clínicopatológicos y, por lo tanto, potencialmente utilizarse para la identificación de biomarcadores.
Introduction
El desarrollo de agentes anticancerígenos eficaces y seguros requiere modelos preclínicos adecuados que también puedan proporcionar información sobre los mecanismos de acción que pueden facilitar la identificación de biomarcadores predictivos y farmacodinámicos. Se sabe que la heterogeneidad inter e intratumoral1,2,3,4,5 y la TME6, 7,8,9,10,11,12 influyen en las respuestas a los medicamentos contra el cáncer, y muchos modelos de cáncer preclínicos existentes, como líneas celulares, organoides y modelos de ratón, no pueden acomodar completamente estos modelos cruciales. Funciones. Un modelo “ideal” es aquel que puede recapitular las complejas interacciones espaciales de las células malignas con las no malignas dentro de los tumores, así como reflejar las diferencias regionales dentro de los tumores. Este artículo se centra en las PDE como una plataforma emergente que puede cumplir muchos de estos requisitos13.
El primer ejemplo del uso de PDE humanos, también conocidos como histocultivos, se remonta a finales de la década de 1980 cuando Hoffman et al. generaron rebanadas de tumores humanos recién resecados y los cultivaron en una matriz de colágeno14,15. Esto implicó el establecimiento de un sistema de cultivo 3D que preservó la arquitectura del tejido, asegurando el mantenimiento de los componentes del estroma y las interacciones celulares dentro de la EMT. Sin deconstruir el tumor original, Hoffman et al.16 anunciaron un nuevo enfoque de investigación traslacional, y desde entonces, muchos grupos han optimizado diferentes métodos de explante con el objetivo de preservar la integridad del tejido y generar datos precisos de respuesta al fármaco17,18,19,20,21,22,23,24 , aunque son evidentes algunas diferencias entre protocolos. Butler et al. cultivaron explantes en esponjas de gelatina para ayudar a la difusión de nutrientes y fármacos a través de los especímenes20,21,25,mientras que Majumder et al. crearon un ecosistema tumoral cultivando explantes sobre una matriz compuesta por proteínas tumorales y estromales en presencia de suero autólogo derivado del mismo paciente22, 23.
Más recientemente, nuestro grupo estableció un protocolo por el cual los explantes se generan por fragmentación de tumores en piezas de 2 a 3 mm de tamaño 3 queluegose colocan sin componentes adicionales en membranas permeables en la interfaz aire-líquido de un sistema de cultivo24. Tomados en conjunto, estos numerosos estudios han demostrado que los PDE permiten el cultivo de fragmentos intactos y vivos de tumores humanos que conservan la arquitectura espacial y la heterogeneidad regional de los tumores originales. En los experimentos originales, los explantes o histocultivos generalmente se sometieron a homogeneización después del tratamiento farmacológico, después de lo cual se aplicaron varios ensayos de viabilidad a las muestras homogeneizadas, como el ensayo de respuesta al fármaco de histocultivo20,21, el ensayo MTT (3-(6)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), el ensayo de lactato deshidrogenasa o el ensayo basado en resazurina26,27,28 . Los avances recientes en las técnicas de análisis de endpoints, particularmente la patología digital, han ampliado el repertorio de pruebas y ensayos de endpoints que se pueden realizar en explantes29,30. Para aplicar estas nuevas tecnologías, en lugar de homogeneización, los explantes se fijan en formalina, se incrustan en parafina (FFPE) y luego se analizan mediante técnicas de inmunotinción, lo que permite el perfil espacial. Se han documentado ejemplos de este enfoque para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), el cáncer de mama, el cáncer colorrectal y los explantes de mesotelioma mediante los cuales se utilizó tinción inmunohistoquímica para el marcador de proliferación, Ki67, y el marcador apoptótico, poli-ADP ribosa polimerasa escindida (cPARP), para monitorear los cambios en la proliferación celular y la muerte celular24,31,32,33,34.
La inmunofluorescencia multiplexada es particularmente susceptible de perfil espacial de las respuestas farmacológicas en explantes en el punto final35. Por ejemplo, es posible medir la relocalización y distribución espacial de clases específicas de células inmunes, como macrófagos o células T, dentro de la EMT tras el tratamiento farmacológico13,36,37,38,e investigar si un agente terapéutico puede favorecer la transición de “tumor frío” a “tumor caliente”39 . En los últimos años, este grupo se ha centrado en la derivación de PDE de diferentes tipos de tumores (NSCLC, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer colorrectal, melanoma) y la prueba de una variedad de agentes anticancerígenos que incluyen quimioterapias, inhibidores de moléculas pequeñas e inhibidores del punto de control inmunitario (ICI). Los métodos de análisis de endpoints se han optimizado para incluir inmunofluorescencia multiplexada para permitir el perfil espacial de biomarcadores de viabilidad, así como biomarcadores para diferentes constituyentes de la EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe los métodos para la generación, el tratamiento farmacológico y el análisis de las PDE y destaca las ventajas de la plataforma como sistema modelo preclínico. El cultivo ex vivo de un tumor recién resecado, que no implica su deconstrucción, permite la retención de la arquitectura tumoral13,24 y, por lo tanto, las interacciones espaciales de los componentes celulares en la EMT, así como la heterogeneidad intratumoral. Este método d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los cirujanos y patólogos de University Hospitals of Leicester NHS Trust por proporcionar tejido tumoral resecado quirúrgico. También agradecemos a la instalación de Histología dentro de Core Biotechnology Services por su ayuda con el procesamiento de tejidos y la seccionamiento de bloques de tejido FFPE y a Kees Straatman por su apoyo con el uso de Vectra Polaris. Esta investigación fue apoyada y financiada por el Consorcio Explant compuesto por cuatro socios: la Universidad de Leicester, la Unidad de Toxicología MRC, los Laboratorios de Descubrimiento Terapéutico de Cancer Research UK y LifeArc. El CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151) proporcionó apoyo adicional. El financiamiento para GM, CD y NA fue proporcionado por el Programa Catalyst de Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066), que cuenta con el apoyo de fondos de Pfizer.
Materials
| Acetic acid | Sigma | 320099 | Staining reagent |
| Antibody Diluent / Block, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | Antibody diluent/blocking buffer |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma-Aldrich | C7129 | Reagent for citrate buffer |
| Costar Multiple Well Cell Culture Plates | Corning Incorporated | 3516 | 6 multiwell plate |
| DAPI Dilactate | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 100 mm diameter dish for tissue culture |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | Tissue culture medium (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | Mounting medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | Reagent for TE buffer |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | Staining reagent |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | For use in tissue culture medium |
| 37% Formaldehyde | Fisher (Acros) | 119690010 | 10% Formalin |
| iGenix, microwave oven IG2095 | iGenix | IG2095 | Microwave used for antigen retreival |
| Industrial methylated spirit (IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% Industrial Denatured Alcohol (IDA) |
| InForm Advanced Image Analysis Software | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | Leica Biosystems | Rotary microtome | |
| Leica ST4040 Linear Stainer | Leica Biosystems | H&E stainer | |
| Mayer's Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | Staining reagent |
| Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Merck Milipore | PICMORG50 | Organotypic culture insert disc |
| Novolink Polymer Detection System | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB staining kit |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent | Akoya Biosciences | FP1501001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | For use in tissue culture medium |
| PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer | Akoya Biosciences | PhenoChart | Viewer software for scanned images |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% Formalin |
| Sodium Hydroxide pellets | Fisher Scientific | S/4920/53 | Reagent for citrate buffer |
| Tenatex Toughened Wax – Pink (500 g) | KEMDENT | 1-601 | Dental wax surface |
| Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center | Fisher Scientific | 10098889 | Holder for slides and slide clips |
| Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates | Fisher Scientific | 11927774 | Slide clips |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | Reagent for TE buffer |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | Mounting medium |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | De-waxing agent |
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