Il sistema bipartito GAL4-UAS è uno strumento versatile per la modifica dell'espressione genica in modo spaziotemporale controllato che consente l'analisi genetica funzionale in Anopheles gambiae. Le procedure descritte per l'utilizzo di questo sistema sono una strategia di clonazione semi-standardizzata, sexing e screening delle pupe per marcatori proteici fluorescenti e fissazione dell'embrione.
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Articolo metodologico
Utilizzo del sistema GAL4-UAS per la genetica funzionale in Anopheles gambiae
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema bipartito GAL4-UAS è uno strumento versatile e potente per l'analisi genetica funzionale. L'essenza del sistema è quella di incrociare linee transgeniche "driver" che esprimono il fattore di trascrizione del lievito GAL4 in modo specifico per il tessuto, con linee transgeniche "responder" portatrici di un costrutto di interferenza gene/RNA candidato la cui espressione è controllata da Upstream Activation Sequences (UAS) che legano GAL4. Nella progenie che ne consegue, il gene o il costrutto di silenziamento è quindi espresso in modo spaziotemporale prescritto, consentendo di dosare i fenotipi risultanti e di dedurre la funzione genica. Il sistema binario consente flessibilità negli approcci sperimentali per lo screening dei fenotipi generati dall'espressione transgenica in più modelli tessuto-specifici, anche se sono indotti gravi costi di fitness. Abbiamo adattato questo sistema per Anopheles gambiae, il principale vettore di malaria in Africa.
In questo articolo vengono fornite alcune delle procedure comuni utilizzate durante l'analisi GAL4-UAS. Descriviamo le linee An. gambiae GAL4-UAS già generate, così come la clonazione di nuovi costrutti di responder per l'upregulation e il knockdown RNAi. Specifichiamo una guida passo passo per il sexing delle pupe di zanzara per stabilire incroci genetici, che include anche lo screening della progenie per seguire l'ereditarietà di marcatori genetici fluorescenti che etichettano le inserzioni del conducente e del soccorritore. Presentiamo anche un protocollo per la rimozione degli embrioni di An. gambiae per studiare lo sviluppo embrionale. Infine, introduciamo potenziali adattamenti del metodo per generare linee driver attraverso l'inserimento CRISPR/Cas9 di GAL4 a valle dei geni bersaglio.
Introduzione
Il sistema bipartito GAL4-UAS è il cavallo di battaglia della caratterizzazione funzionale dei geni nell'organismo modello di insetto Drosophila melanogaster1,2,3. Per utilizzare il sistema GAL4-UAS, le linee driver transgeniche, che esprimono il fattore di trascrizione del lievito GAL4 sotto il controllo di una sequenza regolatoria, vengono incrociate con linee di responder portatrici di un costrutto di genico di interesse o di interferenza dell'RNA (RNAi) controllato da una sequenza di attivazione a monte (UAS) riconosciuta da GAL4. La progenie di questa croce espr....
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Protocollo
1. Progettazione e costruzione di costrutti UAS
- Progettazione e assemblaggio di vettori per l'espressione genica candidata
- Determinare la sequenza da utilizzare per l'upregulation del gene candidato.
- Sequenziare il cDNA/gDNA dal ceppo di interesse e confrontarlo con la sequenza pubblicata per verificarne l'identità e identificare potenziali SNP e siti di restrizione per il digest diagnostico.
- Assicurarsi che il primer in avanti utilizzato per l'amplificazione genica copra la sequenza nativa di Kozak e il codone di inizio, se del caso. Un primer con ~10 bp di legame a monte del codone di partenza....
- Determinare la sequenza da utilizzare per l'upregulation del gene candidato.
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Risultati
L'espressione 3xP3 di eYFP, dsRed ed eCFP fornisce un'identificazione affidabile e facilmente distinguibile degli individui che possiedono i geni marcatori che producono espressione negli occhi e nei gangli ventrali di An. gambiae pupae (Figura 3). La morfologia differenziale osservata nei genitali esterni maschili e femminili utilizzati per il sexing e un esempio di pupe non identificabili sono evidenziati nella Figura 4. La rimozione di tutta.......
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Discussione
Comprendere la funzione del gene della zanzara è vitale per sviluppare nuovi approcci per controllare l'anofele e influenzare la trasmissione della malaria. Il sistema GAL4-UAS descritto è un sistema versatile e potente per l'analisi funzionale dei geni candidati e ad oggi abbiamo utilizzato il sistema per esaminare le basi genetiche della resistenza agli insetticidi17 e della produzione di idrocarburi cuticolari15,23, nonché per etichettare fluorescentemente diverse popolazioni di cellul.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo con gratitudine i finanziamenti di LSTM e IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (PhD studentship a BCP: MR / P016197 / 1), Wellcome (Sir Henry Wellcome Postdoctoral fellowship to LG: 215894 / Z / 19 / Z) che hanno incorporato l'analisi Gal4UAS nelle proposte.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra Petri in plastica 100 x 15 mm | SLS | 2175546 | Confezione da 10 1000 |
| µ L Gilson Pipetta Gilson | F144059P | ||
| 20/25 mL Provette universali | Starlab | E1412-3020 | Confezione da 400 |
| pipette Pasteur da 3 mL | SLS | G612398 | Pipetta Greiner Pasteur 3 mL sterile confezionata singolarmente |
| 50 mL Provette Falcon | Fisher Scientific | 11512303 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-500 | 500 mL |
| Acido acetico | SLS | 45726-1L-F | 1 L |
| Gabbie | SLS | E6099 | 30x30x30 con porta schermo |
| Pennelli fini | Amazon | UKDPB66 | KOLAMOON 9 pezzi Set di pennelli per pittura dettagliata Pennelli per acquerello, pittura acrilica, pittura a olio (vino rosso) |
| cibo per pesci | Amazon | Tetra Min Fish Food, Alimento completo per tutti i pesci tropicali per salute, colore e vitalità, 10 l | |
| Soluzione di formaldeide | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aspiratore per bocca | John Hock | 612 | |
| Sale per laghetto | Amazon | Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, per la salute dei pesci, qualità dell'acqua, tonico generale, tampone pH, 9,08 kg, tratta 9.092 L | |
| Pentole Pupae | Cater4you | SP8OZ | 250 pentole con coperchi |
| Secchi in Plastica Piccoli | Amazon | 2,5 L Secchio in Plastica Bianco Completo di Coperchio Bianco (Confezione da 10) | |
| Ipoclorito di sodio | Fisher Scientific | S25552 |
Riferimenti
- Brand, A. H., Perimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.<....
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Ristampe e permessi
