Vurdering biofilm spredning i Murine Sår

Summary

Her beskriver vi ex vivo- og in vivo-metoder til vurdering af bakteriespredning fra en sårinfektion hos mus. Denne protokol kan anvendes til at teste effekten af aktuelle antimikrobielle og antibiofilmbehandlinger eller til at vurdere spredningskapaciteten af forskellige bakteriestammer eller arter.

Abstract

Biofilm-relaterede infektioner er impliceret i en bred vifte af kroniske tilstande såsom ikke-helbredende diabetisk fodsår, kronisk bihulebetændelse, tilbagevendende otitis medier, og mange flere. Mikrobielle celler i disse infektioner er beskyttet af et ekstracellulært polymerstof (EPS), som kan forhindre antibiotika og vært immunceller i at rydde infektionen. For at overvinde denne hindring, efterforskere er begyndt at udvikle spredningsmidler som potentielle terapeutiske. Disse midler målrette forskellige komponenter i biofilm EPS, svække strukturen, og indlede spredning af bakterier, som teoretisk kan forbedre antibiotika potens og immun clearance. For at bestemme effekten af spredningsmidler til sårinfektioner har vi udviklet protokoller, der måler biofilmspredning både ex vivo og in vivo. Vi bruger en musekirurgisk excision model, der er blevet godt beskrevet til at skabe biofilm-associerede kroniske sårinfektioner. For at overvåge spredning in vivoinficerer vi sårene med bakteriestammer, der udtrykker luciferase. Når modne infektioner er etableret, overrisler vi sårene med en opløsning, der indeholder enzymer, der nedbryder komponenter i biofilmen EPS. Vi overvåger derefter placeringen og intensiteten af det selvlysende signal i såret og filtreringsorganerne for at give oplysninger om det opnåede spredningsniveau. Til ex vivo-analyse af biofilmspredning nedsænkes inficeret sårvæv i biofilmnedbrydende enzymopløsning, hvorefter den bakterielle belastning, der er tilbage i vævet, i forhold til bakteriebelastningen i opløsning vurderes. Begge protokoller har styrker og svagheder og kan optimeres til at hjælpe præcist med at bestemme effekten af spredningsbehandlinger.

Introduction

Stigningen i antibiotikaresistens på verdensplan fører til mangel på antibiotika muligheder for at behandle en række bakterielle infektioner¹. Ud over antibiotikaresistens kan bakterier få antibiotikatolerance ved at vedtage en biofilm-associeret livsstil². En biofilm er et fællesskab af mikroorganismer, der er beskyttet af en matrix af polysaccharider, ekstracellulært DNA, lipider og proteiner³, kollektivt kaldet det ekstracellulære polymere stof (EPS). Som antibiotikaresistens krisen fortsætter, nye strategier, der forlænger brugen af, eller forstærke effekten af antibiotika er hårdt tiltrængt. Antibiofilmmidler er en lovende løsning⁴.

Blandt de forskellige antibiofilmstrategier, der er blevet foreslået, er udnyttelsen af spredningsmidler, der er målrettet mod forskellige komponenter i biofilmEN EPS, på forkant med terapeutisk udvikling⁵. Glycoside hydrolaser (GH) er en sådan klasse af spredningsmiddel. GH er en stor klasse af enzymer, der katalyserer kavalergangen af forskellige bindinger inden for polysaccharider, der giver strukturel integritet til EPS. Vores gruppe, såvel som andre, har vist, at GH effektivt kan nedbryde biofilm, fremkalde spredning og forbedre antibiotikaeffektiviteten for en række forskellige bakteriearter, både in vitro og in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

Med en stigende interesse for spredning af biofilm er det vigtigt at udvikle effektive metoder, der vurderer spredningseffektiviteten. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til behandling af biofilmrelaterede sårinfektioner med et spredningsmiddel hos mus og vurdering af spredningseffektivitet, in vivo og ex vivo. Det overordnede mål er at levere effektive metoder, der kan bruges med prækliniske modeller til at måle biofilmspredning effektivt.

En murin kirurgisk excision infektion model blev brugt i disse undersøgelser for at etablere en biofilm-associeret infektion. Vi har brugt denne model i over 15 år og offentliggjort vores observationer i vid udstrækning^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. Generelt er dette en ikke-dødelig infektion model, hvor bakterier forbliver lokaliseret til sårbunden og er biofilm-associeret (bakterier ses i aggregater omgivet af EPS), oprettelse af en kronisk infektion, der varer op til 3 uger. Men hvis mus er immunkompromitterede (f.eks. med type 1-diabetes), kan de blive mere modtagelige for at udvikle en dødelig systemisk infektion i denne model.

I denne rapport giver vi protokoller til vurdering af spredningen af bakterier fra et sår, både in vivo og ex vivo. Begge protokoller kan bruges til at undersøge effekten af et spredningsmiddel og have deres egne styrker og svagheder. For eksempel kan vurdering af spredning in vivo give vigtige realtidsoplysninger om spredning af bakterier til andre dele af kroppen efter spredning, og hvordan værten reagerer. På den anden side kan det være mere ønskeligt at vurdere spredningsudsnit til screening af flere agenser, doser eller formuleringer, da vævet kan opdeles i flere sektioner, der kan testes separat, hvilket reducerer antallet af mus, der kræves. Ved vurdering af flere agenter måler vi typisk spredning først in vitro som tidligere beskrevet ^6,9,22. Derefter tester vi den mest effektive ex vivo- og reserve in vivo-testning for et begrænset antal meget lovende stoffer.

Protocol

Denne dyreprotokol blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center (protokolnummer 07044). Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health. 1. Forberedelse af bakterier til museinfektioner BEMÆRK: Her beskriver vi kun inficere mus med Pseudomonas aeruginosa. Andre bakteriear…

Representative Results

I dette eksperiment blev 8-10 uger gamle kvindelige schweiziske Webster mus smittet med 104 CFU af PAO1 transporterer luminescens plasmid pQF50-lux. Som beskrevet ovenfor fik en infektion lov til at fastslå for 48 timer før administration af 3 x 30 min behandlinger af enten PBS (køretøjskontrol) eller 10% GH (behandling) for at fordøje biofilm EPS. Mus blev afbildet forbehandling, direkte efter behandling (0 h) og ved 10 timer og 20 timer efter behandlingen. Figur 2A og<stron…

Discussion

Her beskriver vi protokoller, der kan bruges til at studere effekten af biofilm dispergringsmidler. Disse protokoller kan let tilpasses til brug med forskellige typer spredningsmidler, bakteriearter eller ex vivo-prøver, herunder kliniske debridementprøver. Denne protokol giver også en klinisk relevant model til at indsamle og studere spredte bakterieceller. Det har vist sig, at fænotyperne af spredte bakterieceller adskiller sig fra dem, der findes i enten planktoniske celler eller biofilmceller <sup class=…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment