Beoordeling van biofilmdispersie in muriene wonden

Summary

Hier beschrijven we ex vivo en in vivo methoden voor het beoordelen van bacteriële dispersie van een wondinfectie bij muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om de werkzaamheid van topische antimicrobiële en antibiofilmtherapieën te testen, of om de dispersiecapaciteit van verschillende bacteriestammen of soorten te beoordelen.

Abstract

Biofilm-gerelateerde infecties zijn betrokken bij een breed scala aan chronische aandoeningen zoals niet-genezende diabetische voetzweren, chronische sinusitis, terugkerende otitis media en nog veel meer. Microbiële cellen binnen deze infecties worden beschermd door een extracellulaire polymere stof (EPS), die kan voorkomen dat antibiotica en gastheerimmuuncellen de infectie verwijderen. Om dit obstakel te overwinnen, zijn onderzoekers begonnen met het ontwikkelen van dispergeermiddelen als potentiële therapieën. Deze middelen richten zich op verschillende componenten in de biofilm EPS, verzwakken de structuur en initiëren de verspreiding van de bacteriën, wat theoretisch de potentie van antibiotica en immuunklaring kan verbeteren. Om de werkzaamheid van dispersiemiddelen voor wondinfecties te bepalen, hebben we protocollen ontwikkeld die biofilmdispersie zowel ex vivo als in vivo meten. We gebruiken een muis chirurgisch excisiemodel dat goed is beschreven om biofilm-geassocieerde chronische wondinfecties te creëren. Om de dispersie in vivote controleren, infecteren we de wonden met bacteriële stammen die luciferase uitdrukken. Zodra volwassen infecties zijn vastgesteld, irrigeren we de wonden met een oplossing die enzymen bevat die componenten van de biofilm EPS afbreken. Vervolgens monitoren we de locatie en intensiteit van het lichtgevende signaal in de wond en filteren we organen om informatie te geven over het bereikte verspreidingsniveau. Voor ex vivo analyse van biofilmdispersie wordt geïnfecteerd wondweefsel ondergedompeld in biofilmafbrekende enzymoplossing, waarna de bacteriële belasting die in het weefsel achterbleef, versus de bacteriële belasting in oplossing, wordt beoordeeld. Beide protocollen hebben sterke en zwakke punten en kunnen worden geoptimaliseerd om de effectiviteit van dispersiebehandelingen nauwkeurig te bepalen.

Introduction

De toename van antibioticaresistentie wereldwijd leidt tot een gebrek aan antibioticaopties om een verscheidenheid aan bacteriële infecties te behandelen¹. Naast antibioticaresistentie kunnen bacteriën antibioticatolerantie krijgen door een biofilm-geassocieerde levensstijl aan te nemen². Een biofilm is een gemeenschap van micro-organismen die worden beschermd door een matrix van polysachariden, extracellulair DNA, lipiden en eiwitten³, gezamenlijk de extracellulaire polymere stof (EPS) genoemd. Naarmate de antibioticaresistentiecrisis voortduurt, zijn nieuwe strategieën nodig die het gebruik van antibiotica verlengen of de werkzaamheid ervan versterken. Anti-biofilmmiddelen zijn een veelbelovende oplossing⁴.

Onder de verschillende anti-biofilmstrategieën die zijn voorgesteld, loopt het gebruik van dispergeermiddelen, die zich richten op verschillende componenten van de biofilm EPS, voorop in de therapeutische ontwikkeling⁵. Glycosidehydrolasen (GH) zijn zo’n klasse van dispergeermiddel. GH zijn een grote klasse enzymen die het decolleté van verschillende bindingen binnen de polysachariden katalyseren die structurele integriteit bieden aan de EPS. Onze groep, evenals anderen, hebben aangetoond dat GH biofilms effectief kan afbreken, dispersie kan induceren en de werkzaamheid van antibiotica kan verbeteren voor een aantal verschillende bacteriesoorten, zowel in vitro als in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

Met een groeiende interesse in biofilm dispersie, is het belangrijk om effectieve methoden te ontwikkelen die de dispersie-werkzaamheid beoordelen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de behandeling van biofilm-geassocieerde wondinfecties met een dispergeermiddel bij muizen, en de beoordeling van de dispersie-werkzaamheid, in vivo en ex vivo. Het algemene doel is om effectieve methoden te bieden die kunnen worden gebruikt met preklinische modellen om biofilmdispersie effectief en efficiënt te meten.

Een murien chirurgisch excisie infectiemodel werd in deze studies gebruikt om een biofilm-geassocieerde infectie vast te stellen. We gebruiken dit model al meer dan 15 jaar en publiceerden onze observaties uitgebreid^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. Over het algemeen is dit een niet-dodelijk infectiemodel waarbij bacteriën gelokaliseerd blijven in het wondbed en biofilm-geassocieerd zijn (bacteriën gezien in aggregaten omringd door EPS), waardoor een chronische infectie wordt opgezet die tot 3 weken duurt. Als muizen echter immuungecompromitteerd zijn (met type 1 diabetes bijvoorbeeld), kunnen ze vatbaarder worden voor het ontwikkelen van een fatale systemische infectie in dit model.

In dit rapport bieden we protocollen voor het beoordelen van de verspreiding van bacteriën uit een wond, zowel in vivo als ex vivo. Beide protocollen kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van een dispergeermiddel te onderzoeken en hebben hun eigen sterke en zwakke punten. Het beoordelen van dispersie in vivo kan bijvoorbeeld belangrijke, realtime informatie opleveren over de verspreiding van bacteriën naar andere delen van het lichaam na dispersie en hoe de gastheer reageert. Aan de andere kant kan het beoordelen van dispersie ex vivo wenselijker zijn voor het screenen van meerdere middelen, doses of formuleringen, omdat het weefsel kan worden onderverdeeld in meerdere secties die afzonderlijk kunnen worden getest, waardoor het aantal benodigde muizen wordt verminderd. Bij het beoordelen van meerdere middelen meten we meestal dispersie eerst in vitro zoals eerder beschreven ^6,9,22. Vervolgens testen we de meest effectieve ex vivo en reserveren we in vivo testen voor een beperkt aantal veelbelovende middelen.

Protocol

Dit dierprotocol is beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Texas Tech University Health Sciences Center (protocolnummer 07044). Deze studie is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de Nationale Instituten voor Gezondheid. 1. Bacteriën voorbereiden op muizeninfecties OPMERKING: Hier beschrijven we het infecteren van muizen alleen met Ps…

Representative Results

In dit experiment werden 8-10 weken oude vrouwelijke Zwitserse Webster muizen geïnfecteerd met 104 KVE van PAO1 met de luminescentie plasmide pQF50-lux. Zoals hierboven beschreven, mocht een infectie gedurende 48 uur worden vastgesteld voordat 3 x 30 minuten behandelingen van PBS (voertuigcontrole) of 10% GH (behandeling) werden toegediend om de biofilm EPS te verteren. Muizen werden voor de behandeling afgebeeld, direct na de behandeling (0 uur) en om 10 uur en 20 uur na de behandeling. …

Discussion

Hier beschrijven we protocollen die kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van biofilmdispersiemiddelen te bestuderen. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast aan gebruik met verschillende soorten dispergeermiddelen, bacteriesoorten of ex vivo monsters, waaronder klinische debridement monsters. Dit protocol biedt ook een klinisch relevant model om gedispergeerde bacteriële cellen te verzamelen en te bestuderen. Het is aangetoond dat de fenotypen van gedispergeerde bacteriële cellen verschillen va…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment