הערכת פיזור ביופילם בפצעי מורין

Summary

כאן, אנו מתארים אקס ויוו ושיטות vivo להערכת פיזור חיידקים מזיהום פצע בעכברים. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי לבדוק את היעילות של טיפולים אנטי מיקרוביאלית אקטואלי אנטי ביופילם, או כדי להעריך את יכולת הפיזור של זנים חיידקיים שונים או מינים שונים.

Abstract

זיהומים הקשורים Biofilm מעורבים במגוון רחב של מצבים כרוניים כגון כיבים ברגל סוכרתית שאינם ריפוי, סינוסיטיס כרונית, מדיה דלקת אוזניים חוזרת, ועוד רבים. תאים מיקרוביאליים בתוך זיהומים אלה מוגנים על ידי חומר פולימרי חוץ תאי (EPS), אשר יכול למנוע אנטיביוטיקה ולארח תאים חיסוניים מפני ניקוי הזיהום. כדי להתגבר על מכשול זה, חוקרים החלו לפתח סוכני פיזור כטיפולים פוטנציאליים. סוכנים אלה מתמקדים ברכיבים שונים בתוך ה- EPS של הביופילם, מחלישים את המבנה ויוזמים פיזור של החיידקים, אשר תיאורטית יכול לשפר את העוצמה האנטיביוטית ואת הסיווג החיסוני. כדי לקבוע את היעילות של סוכני פיזור עבור זיהומים פצע, פיתחנו פרוטוקולים המודדים פיזור biofilm הן ex vivo ו in vivo. אנו משתמשים במודל כריתה כירורגית של עכבר שתואר היטב כדי ליצור זיהומים כרוניים הקשורים לביופילם. כדי לפקח על פיזור vivo, אנו מדביקים את הפצעים עם זנים חיידקיים המבטאים לוציפראז. לאחר זיהומים בוגרים הוקמו, אנו להשקות את הפצעים עם פתרון המכיל אנזימים להשפיל רכיבים של EPS biofilm. לאחר מכן אנו עוקבים אחר המיקום והעוצמה של האות הזוהר בפצע ואיברים מסננים כדי לספק מידע על רמת הפיזור שהושגה. לניתוח ex vivo של פיזור biofilm, רקמת פצע נגוע שקוע בתמיסת אנזים משפיל biofilm, ולאחר מכן עומס חיידקי שנותר ברקמה, לעומת עומס חיידקי בתמיסה, מוערך. שני הפרוטוקולים יש חוזקות וחולשות והוא יכול להיות אופטימיזציה כדי לעזור לקבוע במדויק את היעילות של טיפולים פיזור.

Introduction

עליית עמידות לאנטיביוטיקה ברחבי העולם מובילה לחוסר אפשרויות אנטיביוטיות לטיפול במגוון זיהומים חיידקיים¹. בנוסף לעמידות לאנטיביוטיקה, חיידקים יכולים להשיג סובלנות אנטיביוטית על ידי אימוץ אורח חיים הקשור לביופילם². ביופילם היא קהילה של מיקרואורגניזמים המוגנים על ידי מטריצה של פוליסכרידים, דנ”א חוץ תאי, שומנים וחלבונים³, הנקראים באופן קולקטיבי החומר הפולימרי החוץ תאי (EPS). ככל שמשבר ההתנגדות לאנטיביוטיקה נמשך, אסטרטגיות חדשות המאריכות את השימוש, או מחזקות את היעילות של, אנטיביוטיקה נחוצות מאוד. סוכני אנטי-ביופילם הם פתרון מבטיח אחד⁴.

בין אסטרטגיות אנטי-ביופילם שונות שהוצעו, ניצול סוכני פיזור, אשר למקד רכיבים שונים של EPS biofilm, נמצאים בחזית הפיתוח הטיפולי⁵. גליקוסייד הידרולאס (GH) הם סוג אחד כזה של חומר פיזור. GH הם סוג גדול של אנזימים לזרז את המחשוף של קשרים שונים בתוך פוליסכרידים המספקים שלמות מבנית EPS. הקבוצה שלנו, כמו גם אחרים, הראו כי GH יכול ביעילות להשפיל biofilms, לגרום לפיזור ולשפר את היעילות האנטיביוטית עבור מספר מינים חיידקיים שונים, הן במבחנה והן vivo^{6,7,8,9,10,11}.

עם עניין גובר פיזור biofilm,חשוב לפתח שיטות יעילות להעריך את יעילות הפיזור. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לטיפול בדלקות פצע הקשורות biofilm עם סוכן פיזור בעכברים, ואת ההערכה של יעילות פיזור, ב vivo ו ex vivo. המטרה הכוללת היא לספק שיטות יעילות שניתן להשתמש בהן עם מודלים פרה-קוליניים למדידת פיזור ביופילם ביעילות וביעילות.

מודל זיהום כריתה כירורגית מורין שימש במחקרים אלה כדי להקים זיהום הקשורים biofilm. השתמשנו במודל זה למעלה מ-15 שנה ופרסמנו את התצפיות שלנו בהרחבה^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21.} באופן כללי, זהו מודל זיהום לא קטלני שבו חיידקים נשארים מקומיים למיטת הפצע והם הקשורים לביופילם (חיידקים הנראים בצבירות המוקפות ב- EPS), ומגדירים זיהום כרוני שנמשך עד 3 שבועות. עם זאת, אם עכברים הם immunocompromised (עם סוכרת מסוג 1 למשל), הם יכולים להיות רגישים יותר לפתח זיהום מערכתי קטלני במודל זה.

בדו”ח זה, אנו מספקים פרוטוקולים להערכת פיזור של חיידקים מפצע, הן vivo ו ex vivo. שני הפרוטוקולים יכולים לשמש כדי לבחון את היעילות של סוכן פיזור ויש להם נקודות החוזק והחולשה שלהם. לדוגמה, הערכת פיזור ב vivo יכול לספק חשוב, מידע בזמן אמת על התפשטות חיידקים לחלקים אחרים של הגוף לאחר פיזור, וכיצד המארח מגיב. מצד שני, הערכת ex vivo פיזור עשוי להיות רצוי יותר עבור סינון סוכנים מרובים, מינונים, או ניסוחים, כמו הרקמה ניתן לחלק סעיפים מרובים שניתן לבדוק בנפרד, ובכך להפחית את מספר העכברים הנדרש. בעת הערכת סוכנים מרובים, אנו בדרך כלל למדוד פיזור הראשון במבחנה כפי שתואר קודם לכן ^6,9,22. לאחר מכן אנו בודקים את ex vivo היעיל ביותר ומילואים בדיקות vivo עבור מספר מוגבל של סוכנים מבטיחים מאוד.

Protocol

פרוטוקול זה של בעלי חיים נבדק ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס טק (פרוטוקול מספר 07044). מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. 1. הכנת חיידקים לזיהומים בעכבר <p class="…

Representative Results

בניסוי זה, עכברי וובסטר שוויצריים בני 8-10 שבועות נדבקוב-10 4 CFU של PAO1 הנושאים את פלסמיד הזוהר pQF50-lux. כפי שתואר לעיל, זיהום הורשה להקים במשך 48 שעות לפני מתן 3 x 30 דקות טיפולים של PBS (בקרת רכב) או 10% GH (טיפול) לעכל את EPS biofilm. עכברים צולמו טרום טיפול, מיד לאחר הטיפול (0 שעות) וב 10 שעות ו 20 שעות לאחר הט?…

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את היעילות של סוכני פיזור biofilm. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות לשימוש עם סוגים שונים של חומרי פיזור, מינים חיידקיים או דגימות ex vivo, כולל דגימות פסולת קלינית. פרוטוקול זה מספק גם מודל רלוונטי קלינית לאיסוף וחקר תאים חיידקי…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment