Här beskriver vi ex vivo- och in vivo-metoder för att bedöma bakteriell spridning från en sårinfektion hos möss. Detta protokoll kan användas för att testa effekten av aktuella antimikrobiella och antibiofilmsbehandlingar, eller för att bedöma spridningskapaciteten hos olika bakteriestammar eller arter.
Biofilm-relaterade infektioner är inblandade i ett brett spektrum av kroniska tillstånd såsom icke-helande diabetiker fotsår, kronisk bihåleinflammation, återkommande öroninflammationer media, och många fler. Mikrobiella celler i dessa infektioner skyddas av en extracellulär polymera substans (EPS), som kan förhindra antibiotika och vara värd för immunceller från att rensa infektionen. För att övervinna detta hinder har utredarna börjat utveckla spridningsmedel som potentiella terapier. Dessa medel riktar sig till olika komponenter inom biofilmen EPS, försvagar strukturen och initierar spridning av bakterierna, vilket teoretiskt kan förbättra antibiotikapotens och immunfrihet. För att bestämma effekten av spridningsmedel för sårinfektioner har vi utvecklat protokoll som mäter biofilmsspridning både ex vivo och in vivo. Vi använder en mus kirurgiska excision modell som har beskrivits väl för att skapa biofilm-associerade kroniska sår infektioner. För att övervaka spridning in vivoinfekterar vi såren med bakteriestammar som uttrycker luciferas. När mogna infektioner har etablerats bevattnar vi såren med en lösning som innehåller enzymer som försämrar komponenter i biofilmen EPS. Vi övervakar sedan platsen och intensiteten hos den självlysande signalen i såret och filtreringsorganen för att ge information om den spridningsnivå som uppnåtts. För ex vivo-analys av biofilmsdispersion är infekterad sårvävnad nedsänkt i biofilmsnedbrytande enzymlösning, varefter bakteriebelastningen som finns kvar i vävnaden, jämfört med bakteriebelastningen i lösningen, bedöms. Båda protokollen har styrkor och svagheter och kan optimeras för att noggrant bestämma effekten av spridningsbehandlingar.
Ökningen av antibiotikaresistens över hela världen leder till brist på antibiotikaalternativ för att behandla en mängd bakteriella infektioner1. Förutom antibiotikaresistens kan bakterier få antibiotikatolerans genom att anta en biofilmsrelaterade livsstil2. En biofilm är en gemenskap av mikroorganismer som skyddas av en matris av polysackarider, extracellulärt DNA, lipider ochproteiner 3, kollektivt kallad den extracellulära polymera substansen (EPS). När antibiotikaresistenskrisen fortsätter behövs det i hög kvalitet nya strategier som förlänger användningen av eller förstärker effekten av antibiotika. Antibiofilmsmedel är en lovande lösning4.
Bland de olika antibiofilmsstrategier som har föreslagits ligger användningen av spridningsmedel, som riktar sig till olika komponenter i biofilmen EPS, i framkant av terapeutisk utveckling5. Glykosidhydrolaser (GH) är en sådan klass av spridningsmedel. GH är en stor klass av enzymer som katalyserar klyvningen av olika bindningar inom polysackariderna som ger eps strukturell integritet. Vår grupp, liksom andra, har visat att GH effektivt kan bryta ner biofilmer, inducera spridning och förbättra antibiotikaeffekten för ett antal olika bakteriearter, både in vitro och in vivo6,7,8,9,10,11.
Med ett växande intresse för biofilmsspridning är det viktigt att utveckla effektiva metoder som bedömer spridningseffektiviteten. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för behandling av biofilm-associerade sårinfektioner med ett spridningsmedel hos möss, och bedömning av dispersiv effekt, in vivo och ex vivo. Det övergripande målet är att tillhandahålla effektiva metoder som kan användas med prekliniska modeller för att mäta biofilmsspridning effektivt och effektivt.
En murin kirurgiska excision infektion modell användes i dessa studier för att fastställa en biofilm-associerade infektion. Vi har använt denna modell i över 15 år och publicerat våra observationer omfattande7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. I allmänhet är detta en icke-dödlig infektionsmodell där bakterier förblir lokaliserade till sårbädden och är biofilmsrelaterade (bakterier som ses i aggregat omgivna av EPS), vilket sätter upp en kronisk infektion som varar upp till 3 veckor. Men om möss är immunkomprometterade (med typ 1-diabetes till exempel) kan de bli mer mottagliga för att utveckla en dödlig systemisk infektion i denna modell.
I denna rapport tillhandahåller vi protokoll för att bedöma spridningen av bakterier från ett sår, både in vivo och ex vivo. Båda protokollen kan användas för att undersöka effekten av ett spridningsmedel och ha sina egna styrkor och svagheter. Att bedöma spridning in vivo kan till exempel ge viktig realtidsinformation om spridningen av bakterier till andra delar av kroppen efter spridning och hur värden svarar. Å andra sidan kan bedömning av dispersion ex vivo vara mer önskvärt för screening av flera medel, doser eller formuleringar, eftersom vävnaden kan delas in i flera sektioner som kan testas separat, vilket minskar antalet möss som krävs. Vid bedömning av flera agenter mäter vi vanligtvis spridning första in vitro som tidigare beskrivits 6,9,22. Vi testar sedan de mest effektiva ex vivo- och reservtestningen in vivo för ett begränsat antal mycket lovande agenter.
Här beskriver vi protokoll som kan användas för att studera effekten av biofilmsdispersionsmedel. Dessa protokoll kan enkelt anpassas för användning med olika typer av dispergeringsmedel, bakteriearter eller ex vivo-prover, inklusive kliniska debridementprover. Detta protokoll ger också en kliniskt relevant modell för att samla in och studera spridda bakterieceller. Fenotyperna av spridda bakterieceller har visat sig vara åtskilda från de av antingen planktoniska eller biofilmsceller 5…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. och Jack Denton Wilson Foundation och Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).
1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |