Bedömning av biofilmsspridning i murinsår

Summary

Här beskriver vi ex vivo- och in vivo-metoder för att bedöma bakteriell spridning från en sårinfektion hos möss. Detta protokoll kan användas för att testa effekten av aktuella antimikrobiella och antibiofilmsbehandlingar, eller för att bedöma spridningskapaciteten hos olika bakteriestammar eller arter.

Abstract

Biofilm-relaterade infektioner är inblandade i ett brett spektrum av kroniska tillstånd såsom icke-helande diabetiker fotsår, kronisk bihåleinflammation, återkommande öroninflammationer media, och många fler. Mikrobiella celler i dessa infektioner skyddas av en extracellulär polymera substans (EPS), som kan förhindra antibiotika och vara värd för immunceller från att rensa infektionen. För att övervinna detta hinder har utredarna börjat utveckla spridningsmedel som potentiella terapier. Dessa medel riktar sig till olika komponenter inom biofilmen EPS, försvagar strukturen och initierar spridning av bakterierna, vilket teoretiskt kan förbättra antibiotikapotens och immunfrihet. För att bestämma effekten av spridningsmedel för sårinfektioner har vi utvecklat protokoll som mäter biofilmsspridning både ex vivo och in vivo. Vi använder en mus kirurgiska excision modell som har beskrivits väl för att skapa biofilm-associerade kroniska sår infektioner. För att övervaka spridning in vivoinfekterar vi såren med bakteriestammar som uttrycker luciferas. När mogna infektioner har etablerats bevattnar vi såren med en lösning som innehåller enzymer som försämrar komponenter i biofilmen EPS. Vi övervakar sedan platsen och intensiteten hos den självlysande signalen i såret och filtreringsorganen för att ge information om den spridningsnivå som uppnåtts. För ex vivo-analys av biofilmsdispersion är infekterad sårvävnad nedsänkt i biofilmsnedbrytande enzymlösning, varefter bakteriebelastningen som finns kvar i vävnaden, jämfört med bakteriebelastningen i lösningen, bedöms. Båda protokollen har styrkor och svagheter och kan optimeras för att noggrant bestämma effekten av spridningsbehandlingar.

Introduction

Ökningen av antibiotikaresistens över hela världen leder till brist på antibiotikaalternativ för att behandla en mängd bakteriella infektioner¹. Förutom antibiotikaresistens kan bakterier få antibiotikatolerans genom att anta en biofilmsrelaterade livsstil². En biofilm är en gemenskap av mikroorganismer som skyddas av en matris av polysackarider, extracellulärt DNA, lipider och^{proteiner 3}, kollektivt kallad den extracellulära polymera substansen (EPS). När antibiotikaresistenskrisen fortsätter behövs det i hög kvalitet nya strategier som förlänger användningen av eller förstärker effekten av antibiotika. Antibiofilmsmedel är en lovande lösning⁴.

Bland de olika antibiofilmsstrategier som har föreslagits ligger användningen av spridningsmedel, som riktar sig till olika komponenter i biofilmen EPS, i framkant av terapeutisk utveckling⁵. Glykosidhydrolaser (GH) är en sådan klass av spridningsmedel. GH är en stor klass av enzymer som katalyserar klyvningen av olika bindningar inom polysackariderna som ger eps strukturell integritet. Vår grupp, liksom andra, har visat att GH effektivt kan bryta ner biofilmer, inducera spridning och förbättra antibiotikaeffekten för ett antal olika bakteriearter, både in vitro och in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

Med ett växande intresse för biofilmsspridning är det viktigt att utveckla effektiva metoder som bedömer spridningseffektiviteten. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för behandling av biofilm-associerade sårinfektioner med ett spridningsmedel hos möss, och bedömning av dispersiv effekt, in vivo och ex vivo. Det övergripande målet är att tillhandahålla effektiva metoder som kan användas med prekliniska modeller för att mäta biofilmsspridning effektivt och effektivt.

En murin kirurgiska excision infektion modell användes i dessa studier för att fastställa en biofilm-associerade infektion. Vi har använt denna modell i över 15 år och publicerat våra observationer omfattande^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. I allmänhet är detta en icke-dödlig infektionsmodell där bakterier förblir lokaliserade till sårbädden och är biofilmsrelaterade (bakterier som ses i aggregat omgivna av EPS), vilket sätter upp en kronisk infektion som varar upp till 3 veckor. Men om möss är immunkomprometterade (med typ 1-diabetes till exempel) kan de bli mer mottagliga för att utveckla en dödlig systemisk infektion i denna modell.

I denna rapport tillhandahåller vi protokoll för att bedöma spridningen av bakterier från ett sår, både in vivo och ex vivo. Båda protokollen kan användas för att undersöka effekten av ett spridningsmedel och ha sina egna styrkor och svagheter. Att bedöma spridning in vivo kan till exempel ge viktig realtidsinformation om spridningen av bakterier till andra delar av kroppen efter spridning och hur värden svarar. Å andra sidan kan bedömning av dispersion ex vivo vara mer önskvärt för screening av flera medel, doser eller formuleringar, eftersom vävnaden kan delas in i flera sektioner som kan testas separat, vilket minskar antalet möss som krävs. Vid bedömning av flera agenter mäter vi vanligtvis spridning första in vitro som tidigare ^{beskrivits 6,9,22}. Vi testar sedan de mest effektiva ex vivo- och reservtestningen in vivo för ett begränsat antal mycket lovande agenter.

Protocol

Detta djurprotokoll granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center (protokollnummer 07044). Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Vägledningen för vård och användning av laboratoriedjur vid De nationella hälsoinstituten. 1. Förbereda bakterier för musinfektioner OBS: Här beskriver vi att infektera möss endast med Pseudomonas aeruginosa. …

Representative Results

I detta experiment smittades 8-10 veckor gamla kvinnliga schweiziska Webster möss med 104 CFU av PAO1 som bär luminiscensen plasmid pQF50-lux. Som beskrivits ovan tilläts en infektion att etablera 48 h innan 3 x 30 min behandlingar av antingen PBS (fordonskontroll) eller 10% GH (behandling) för att smälta biofilmen EPS. Mössen avbildades före behandlingen, direkt efter behandling (0 h) och vid 10 h och 20 h efter behandlingen. Figur 2A och kompletterande figur 1 vi…

Discussion

Här beskriver vi protokoll som kan användas för att studera effekten av biofilmsdispersionsmedel. Dessa protokoll kan enkelt anpassas för användning med olika typer av dispergeringsmedel, bakteriearter eller ex vivo-prover, inklusive kliniska debridementprover. Detta protokoll ger också en kliniskt relevant modell för att samla in och studera spridda bakterieceller. Fenotyperna av spridda bakterieceller har visat sig vara åtskilda från de av antingen planktoniska eller biofilmsceller ^5…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment