Her beskriver vi ex vivo- og in vivo-metoder til vurdering af bakteriespredning fra en sårinfektion hos mus. Denne protokol kan anvendes til at teste effekten af aktuelle antimikrobielle og antibiofilmbehandlinger eller til at vurdere spredningskapaciteten af forskellige bakteriestammer eller arter.
Biofilm-relaterede infektioner er impliceret i en bred vifte af kroniske tilstande såsom ikke-helbredende diabetisk fodsår, kronisk bihulebetændelse, tilbagevendende otitis medier, og mange flere. Mikrobielle celler i disse infektioner er beskyttet af et ekstracellulært polymerstof (EPS), som kan forhindre antibiotika og vært immunceller i at rydde infektionen. For at overvinde denne hindring, efterforskere er begyndt at udvikle spredningsmidler som potentielle terapeutiske. Disse midler målrette forskellige komponenter i biofilm EPS, svække strukturen, og indlede spredning af bakterier, som teoretisk kan forbedre antibiotika potens og immun clearance. For at bestemme effekten af spredningsmidler til sårinfektioner har vi udviklet protokoller, der måler biofilmspredning både ex vivo og in vivo. Vi bruger en musekirurgisk excision model, der er blevet godt beskrevet til at skabe biofilm-associerede kroniske sårinfektioner. For at overvåge spredning in vivoinficerer vi sårene med bakteriestammer, der udtrykker luciferase. Når modne infektioner er etableret, overrisler vi sårene med en opløsning, der indeholder enzymer, der nedbryder komponenter i biofilmen EPS. Vi overvåger derefter placeringen og intensiteten af det selvlysende signal i såret og filtreringsorganerne for at give oplysninger om det opnåede spredningsniveau. Til ex vivo-analyse af biofilmspredning nedsænkes inficeret sårvæv i biofilmnedbrydende enzymopløsning, hvorefter den bakterielle belastning, der er tilbage i vævet, i forhold til bakteriebelastningen i opløsning vurderes. Begge protokoller har styrker og svagheder og kan optimeres til at hjælpe præcist med at bestemme effekten af spredningsbehandlinger.
Stigningen i antibiotikaresistens på verdensplan fører til mangel på antibiotika muligheder for at behandle en række bakterielle infektioner1. Ud over antibiotikaresistens kan bakterier få antibiotikatolerance ved at vedtage en biofilm-associeret livsstil2. En biofilm er et fællesskab af mikroorganismer, der er beskyttet af en matrix af polysaccharider, ekstracellulært DNA, lipider og proteiner3, kollektivt kaldet det ekstracellulære polymere stof (EPS). Som antibiotikaresistens krisen fortsætter, nye strategier, der forlænger brugen af, eller forstærke effekten af antibiotika er hårdt tiltrængt. Antibiofilmmidler er en lovende løsning4.
Blandt de forskellige antibiofilmstrategier, der er blevet foreslået, er udnyttelsen af spredningsmidler, der er målrettet mod forskellige komponenter i biofilmEN EPS, på forkant med terapeutisk udvikling5. Glycoside hydrolaser (GH) er en sådan klasse af spredningsmiddel. GH er en stor klasse af enzymer, der katalyserer kavalergangen af forskellige bindinger inden for polysaccharider, der giver strukturel integritet til EPS. Vores gruppe, såvel som andre, har vist, at GH effektivt kan nedbryde biofilm, fremkalde spredning og forbedre antibiotikaeffektiviteten for en række forskellige bakteriearter, både in vitro og in vivo6,7,8,9,10,11.
Med en stigende interesse for spredning af biofilm er det vigtigt at udvikle effektive metoder, der vurderer spredningseffektiviteten. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til behandling af biofilmrelaterede sårinfektioner med et spredningsmiddel hos mus og vurdering af spredningseffektivitet, in vivo og ex vivo. Det overordnede mål er at levere effektive metoder, der kan bruges med prækliniske modeller til at måle biofilmspredning effektivt.
En murin kirurgisk excision infektion model blev brugt i disse undersøgelser for at etablere en biofilm-associeret infektion. Vi har brugt denne model i over 15 år og offentliggjort vores observationer i vid udstrækning7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Generelt er dette en ikke-dødelig infektion model, hvor bakterier forbliver lokaliseret til sårbunden og er biofilm-associeret (bakterier ses i aggregater omgivet af EPS), oprettelse af en kronisk infektion, der varer op til 3 uger. Men hvis mus er immunkompromitterede (f.eks. med type 1-diabetes), kan de blive mere modtagelige for at udvikle en dødelig systemisk infektion i denne model.
I denne rapport giver vi protokoller til vurdering af spredningen af bakterier fra et sår, både in vivo og ex vivo. Begge protokoller kan bruges til at undersøge effekten af et spredningsmiddel og have deres egne styrker og svagheder. For eksempel kan vurdering af spredning in vivo give vigtige realtidsoplysninger om spredning af bakterier til andre dele af kroppen efter spredning, og hvordan værten reagerer. På den anden side kan det være mere ønskeligt at vurdere spredningsudsnit til screening af flere agenser, doser eller formuleringer, da vævet kan opdeles i flere sektioner, der kan testes separat, hvilket reducerer antallet af mus, der kræves. Ved vurdering af flere agenter måler vi typisk spredning først in vitro som tidligere beskrevet 6,9,22. Derefter tester vi den mest effektive ex vivo- og reserve in vivo-testning for et begrænset antal meget lovende stoffer.
Her beskriver vi protokoller, der kan bruges til at studere effekten af biofilm dispergringsmidler. Disse protokoller kan let tilpasses til brug med forskellige typer spredningsmidler, bakteriearter eller ex vivo-prøver, herunder kliniske debridementprøver. Denne protokol giver også en klinisk relevant model til at indsamle og studere spredte bakterieceller. Det har vist sig, at fænotyperne af spredte bakterieceller adskiller sig fra dem, der findes i enten planktoniske celler eller biofilmceller <sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), Ted Nash Long Life Foundation, Jasper L. og Jack Denton Wilson Foundation og Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).
1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |