Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral

Summary

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y transfectar el iris primario y las células epiteliales pigmentarias de la retina de varios mamíferos (ratones, ratas, conejos, cerdos y bovinos). El método es ideal para estudiar los enfoques de terapia génica ocular en varias instalaciones para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos.

Abstract

La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es la causa más frecuente de ceguera en pacientes >60 años, afectando a ~ 30 millones de personas en todo el mundo. La DMAE es una enfermedad multifactorial influenciada por factores ambientales y genéticos, que conducen a un deterioro funcional de la retina debido a la degeneración de las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) seguida de la degradación de los fotorreceptores. Un tratamiento ideal incluiría el trasplante de células RPE sanas que secretan factores neuroprotectores para prevenir la muerte celular RPE y la degeneración de los fotorreceptores. Debido a las similitudes funcionales y genéticas y la posibilidad de una biopsia menos invasiva, se propuso el trasplante de células epiteliales pigmentarias del iris (IPE) como sustituto del EPR degenerado. La secreción de factores neuroprotectores por un bajo número de células trasplantadas subretinalmente se puede lograr mediante la transfección mediada por transposón de la Bella Durmiente (SB100X)con genes que codifican para el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y / o el factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF). Establecimos el aislamiento, el cultivo y la transfección mediada por SB100Xde células RPE e IPE de varias especies, incluidos roedores, cerdos y ganado. Se explantan globos y se extrae la córnea y el cristalino para acceder al iris y la retina. Usando una espátula hecha a medida, las células IPE se eliminan del iris aislado. Para cosechar células RPE, se puede requerir una incubación de tripsina, dependiendo de la especie. Luego, usando espátula personalizada por RPE, las células se suspenden en medio. Después de la siembra, las células son monitoreadas dos veces por semana y, después de llegar a la confluencia, transfectadas por electroporación. La integración génica, la expresión, la secreción de proteínas y la función se confirmaron mediante ensayos qPCR, WB, ELISA, inmunofluorescencia y funcionales. Dependiendo de la especie, se pueden aislar 30.000-5 millones (RPE) y 10.000-1,5 millones de células (IPE) por ojo. Las células modificadas genéticamente muestran una sobreexpresión significativa de PEDF/GM-CSF con la capacidad de reducir el estrés oxidativo y ofrece un sistema flexible para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos para desarrollar enfoques de terapia génica ocular.

Introduction

Nuestro grupo se centra en el desarrollo de enfoques regenerativos para tratar la degeneración neurorretinina, es decir, la DMAE, mediante la terapia génica no viral basada en RPE e IPE. El establecimiento preclínico de tales terapias requiere modelos in vitro transferibles a los seres humanos. Por lo tanto, el objetivo del estudio presentado aquí es entregar protocolos para el aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células primarias de RPE e IPE. La razón para establecer el aislamiento de células de PE de múltiples especies es confirmar sólidamente la seguridad y la eficiencia del enfoque y aumentar su reproducibilidad y transferibilidad. La línea celular de EPR humano disponible ARPE-19 difiere de las células primarias (por ejemplo, están menos pigmentadas) y, por lo tanto, es de valor limitado para los análisis preclínicos¹. Además, las células de mamíferos no humanos se pueden comprar a un costo menor y en mayores cantidades; el tejido de donante humano se puede obtener de varios bancos de ojos, pero la disponibilidad es limitada y costosa. Por último, los nuevos medicamentos de terapia avanzada (ATMP, es decir, células, tejidos o medicamentos de terapia génica) deben aplicarse en al menos dos especies diferentes antes de ser probados en pacientes y estos estudios in vivo solicitan la preparación de trasplantes de células alogénicas.

Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son la principal causa de ceguera en los países industrializados, que comprenden enfermedades comunes como la DMAE, así como enfermedades raras como la retinosis pigmentaria, en la que la muerte de las células de la retina finalmente conduce a la ceguera. El daño de las células RPE, los fotorreceptores y las células ganglionares de la retina (RGC) puede en algunos casos disminuirse, pero actualmente no hay terapias curativas disponibles. Los ATMP ofrecen el potencial de corregir defectos genéticos, integrar genes terapéuticos o reemplazar células degeneradas, lo que permite el desarrollo de terapias regenerativas y curativas para enfermedades como la DMAE; 13 terapias génicas ya obtuvieron la aprobación de comercialización, incluida una terapia para tratar la degeneración retiniana asociada a la mutación RPE65^2,3. Entre los adultos mayores (>60 años), ~ 30 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por la DMAE neovascular (nvAMD) o avascular (aAMD)⁴. Ambas formas son inducidas por desencadenantes asociados a la edad, incluido el daño oxidativo, el deterioro de la función y la pérdida de células RPE, seguidos de la degradación de los fotorreceptores, entre otros (por ejemplo, alelos de riesgo genético, tabaquismo, hipertensión)^5,6. En nvAMD, la patogénesis se ve agravada por un desequilibrio de factores angiogénicos y antiangiogénicos a favor del factor de crecimiento endotelial vascular angiogénico (VEGF) que induce la neovascularización coroidea (CNV). Hasta la fecha, solo la nvAMD es tratable mediante inyecciones intravítreas mensuales de inhibidores de la proteína VEGF para suprimir la CNV; todavía no se dispone de un tratamiento eficaz para la^{AAMD 6,7}.

Varios estudios evaluaron las terapias basadas en células para reemplazar la terapia anti-VEGF: los estudios realizados por Binder et al., en los que se trasplantaron células autólogas de EPR recién cosechadas en pacientes con nAMD^8,9,10,mostraron una mejoría visual moderada, pero solo un pequeño grupo de pacientes alcanzó una agudeza visual final lo suficientemente alta como para permitir la lectura. Recientemente, un estudio clínico de fase I utilizó un parche de ERP derivado de células madre embrionarias para tratar la DMAE con resultados prometedores; es decir, eficacia, estabilidad y seguridad del parche RPE hasta 12 meses en 2 de los 10 pacientes tratados¹¹. Además, varios grupos han publicado estudios en los que se recolectaron parches autólogos de RPE-Bruch-coroides de la retina periférica y se trasplantaron a la mácula^12,13,14; y se generaron parches de EPR derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para trasplante¹⁵. Para la AAMD, los anticuerpos dirigidos a la vía del complemento se han probado en ensayos clínicos^6,16 y se completó un estudio de fase I utilizando una única inyección intravítrea de un vector viral adenoaso asociado (AAV) que codifica el gen para el factor CD59 (AAVCAGsCD59) en pacientes con atrofia geográfica (GA)¹⁷; el estudio de fase II comenzó recientemente y tiene como objetivo reclutar a 132 pacientes con AAMD avanzada y evaluar el resultado a los 2 años posteriores a la intervención¹⁸. Finalmente, el grupo de estudio FocuS ha iniciado un ensayo clínico multicéntrico de fase I/II evaluando la seguridad, dosis-respuesta y eficacia de un vector AAV no replicante recombinante que codifica un factor¹⁹del complemento humano.

Principalmente, el objetivo de una terapia de DMAE regenerativa es el trasplante de células RPE funcionales, que se dañaron o perdieron. Sin embargo, las células IPE y RPE comparten muchas similitudes funcionales y genéticas (por ejemplo, fagocitosis y metabolismo del retinol), y debido a que las células IPE se cosechan de manera más factible, se han propuesto como un sustituto de RPE²⁰. A pesar de que se ha demostrado previamente que el trasplante de células IPE retrasa la degeneración del fotorreceptor en modelos animales^21,22 y estabiliza la función visual en pacientes con nvAMD en etapa final, no se observó una mejoría significativa en estos pacientes²³. La falta de eficacia puede deberse al bajo número de células trasplantadas y/o al desequilibrio de los factores neuroprotectores de la retina. Un enfoque alternativo sería trasplantar células epiteliales pigmentarias transfectadas que sobreexpresan factores neuroprotectores para restaurar la homeostasis retiniana, mantener las células RPE restantes y proteger los fotorreceptores y RGC de la degeneración. En consecuencia, proponemos una nueva terapia que comprende el trasplante de células funcionales de EPR o IPE que han sido sometidas a ingeniería genética para secretar proteínas neuroprotectoras y antiangiogénicas, como PEDF, GM-CSF o factores de crecimiento similares a la insulina (IGF). La ventaja de desarrollar y analizar este enfoque en varias especies en lugar de utilizar una línea celular, una sola especie, o tejido humano es: 1) mayor reproducibilidad y transferibilidad de los resultados como lo demuestran numerosos estudios realizados en laboratorios independientes y diferentes especies^1,24,25; 2) las células de cerdo o bovino son factiblemente desechables sin el sacrificio de animales adicionales; 3) la disponibilidad de células especialmente porcinas y bovinas permite que grandes series de ensayos produzcan resultados sólidos; 4) el conocimiento para aislar, cultivar y modificar genéticamente células a partir de los modelos más utilizados permite realizar análisis in vivo en múltiples especies^{24,25,26 y,}por lo tanto, ofrece una mejor relación riesgo-beneficio para los primeros pacientes tratados; 5) la flexibilidad del protocolo presentado permite su uso en diversos modelos y conjuntos experimentales y para todas las terapias basadas en células oculares con y sin ingeniería genética. Por el contrario, las técnicas alternativas como las líneas celulares o el tejido humano son solo de transferibilidad limitada y / o desechabilidad limitada. Las líneas celulares como el ARPE-19 son ideales para experimentos preliminares; sin embargo, la baja pigmentación y la alta proliferación difieren significativamente de las células primarias¹. Las células RPE e IPE, que se aíslan del tejido de donantes humanos, ofrecen una fuente valiosa para experimentos in vitro transferibles; sin embargo, obtenemos tejido humano de un banco de ojos estadounidense, lo que significa que el tejido tiene al menos dos días de edad (después de la enucleación) y requiere un transporte largo y costoso, pero el tejido del donante local no está disponible en cantidades suficientes para una investigación productiva. La ventaja del uso de células primarias es confirmada por múltiples estudios de otros grupos^27,28.

Para el desarrollo de una terapia génica no viral basada en células utilizando el sistema de transposones SB100X para transfectar células primarias de RPE e IPE con los genes que codifican para PEDF y / o GM-CSF para tratar nvAMD y aAMD, respectivamente^29,30,31,32, primero establecimos la transfección de células ARPE-19¹ . A continuación, se establecieron los protocolos de aislamiento y transfección en células primarias bovinas y porcinas de fácil acceso. Ahora, se ha establecido el aislamiento y la transfección de células primarias de RPE e IPE de cinco especies diferentes, desde pequeños (como ratones) hasta grandes mamíferos (como ganado). Se confirmó en células primarias de RPE e IPE derivadas de ojos de donantes humanos³⁰. La producción del ATMP conforme a las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) se validó utilizando también tejido de donante humano³³. Finalmente, tanto la seguridad como la eficiencia del enfoque se evaluaron in vivo en tres especies diferentes para las que se ha adaptado el protocolo: ratón, rata y conejo. En la configuración clínica, se extraerá una biopsia de iris del paciente y las células IPE se aislarán y transfectarán en la sala limpia, antes de que las células se trasplanten subretinalmente al mismo paciente. Todo el proceso se llevará a cabo durante una sola sesión quirúrgica que dura aproximadamente 60 minutos. El desarrollo del enfoque de tratamiento y la evaluación de su eficiencia solicitaron excelentes modelos in vitro y ex vivo para implementar métodos de administración de genes robustos y eficientes, para analizar la eficiencia de la entrega de genes, la producción terapéutica de proteínas y los efectos neuroprotectores, y para producir trasplantes celulares para probar el enfoque in vivo^{1,24,25,29,30} . Cabe mencionar que la terapia cuenta con la aprobación ética para un ensayo de fase clínica Ib/IIa de la comisión ética para la investigación del Cantón de Ginebra (nº 2019-00250) y actualmente los últimos datos preclínicos solicitados para su autorización por las autoridades reguladoras suizas se recopilan utilizando el protocolo presentado. En este sentido, los datos preclínicos in vivo demostraron una reducción significativa de la NVC y una excelente seguridad^24,25,31.

Aquí, se describe el aislamiento y cultivo de células RPE / IPE de bovinos, cerdos, conejos, ratas y ratones, y el uso del sistema integrador de transposones SB100X combinado con electroporación como un método eficiente de administración de genes. En particular, las células primarias de PE se transfectaron para sobreexpresar PEDF y GM-CSF. La recogida de estos protocolos permite realizar los estudios in vitro e in vivo en todas las fases preclínicas del desarrollo de ATMP. Además, la configuración tiene el potencial de adaptarse a otros genes de interés y enfermedades.

Protocol

Los protocolos en los que participaron los animales fueron llevados a cabo por personal certificado y previa autorización del Departamento cantonal de la seguridad, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale de Ginebra, Suiza, y de acuerdo con la Declaración arVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión (aprobación no. GE/94/17). Las ratas adultas sanas de Brown Norway, los ratones C57BL / 6 y los conejos blancos de Nueva Zelanda fueron sacrificados por una…

Representative Results

Aislamiento de EP de diferentes especies de mamíferosUtilizando los protocolos antes mencionados, las células IPE y RPE se aislaron y cultivaron con éxito de cinco especies diferentes. El número de células obtenidas de cada procedimiento depende de la especie y el tamaño del ojo (Tabla 1). Como se muestra en la Figura 1,las células muestran la morfología y pigmentación típica de las células de PE (a excepción de las células de conejo mostrad…

Discussion

Contar con métodos estandarizados para aislar y cultivar células de EP es fundamental en el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para las enfermedades degenerativas de la retina. Con los protocolos presentados aquí, las células de PE pueden aislarse con éxito de diferentes especies y cultivarse durante largos períodos (hasta ahora, el cultivo más largo se mantuvo durante 2 años^1,38); se observó morfología, pigmentación y función típicas de las…

Materials

12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)