Выделение, культивация и генная инженерия первичных пигментных эпителиальных клеток млекопитающих для невирусной генной терапии

Summary

Здесь представлен протокол выделения и трансфектии первичных пигментных эпителиальных клеток радужной оболочки и сетчатки от различных млекопитающих (мышей, крыс, кроликов, свиней, крупного рогатого готья). Метод идеально подходит для изучения подходов к генной терапии глаз в различных установках для анализа ex vivo и исследований in vivo, переносимых на людей.

Abstract

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является наиболее частой причиной слепоты у пациентов >60 лет, затрагивая ~ 30 миллионов человек во всем мире. ВМД является многофакторным заболеванием, на которое влияют факторы окружающей среды и генетические факторы, которые приводят к функциональному нарушению сетчатки из-за дегенерации пигментных эпителиальных клеток сетчатки (RPE) с последующей деградацией фоторецепторов. Идеальное лечение будет включать трансплантацию здоровых клеток RPE, секретирующих нейропротекторные факторы для предотвращения гибели клеток RPE и дегенерации фоторецепторов. Из-за функционального и генетического сходства и возможности менее инвазивной биопсии в качестве замены дегенерированной РПЭ была предложена трансплантация пигментных эпителиальных клеток радужной оболочки глаза (IPE). Секреция нейропротекторных факторов малым количеством субретинально трансплантированных клеток может быть достигнута транспозонно-опосредованием трансфекции «Спящей красавицы» (SB100X)с генами, кодирующими фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF) и/ или гранулоцитарный макрофагально-колониестимулирующий фактор (GM-CSF). Мы установили изоляцию, культуру и SB100X-опосредованнуютрансфекцию клеток RPE и IPE от различных видов, включая грызунов, свиней и крупный рогатый скот. Глобусы эксплантируются, а роговица и хрусталик удаляются для доступа к радужной оболочке и сетчатке. С помощью изготовленного на заказ шпателя клетки IPE удаляются из изолированной радужной оболочки. Для сбора клеток RPE может потребоваться инкубация трипсина, в зависимости от вида. Затем, используя шпатель, настроенный на RPE, клетки суспензируются в среде. После посева клетки контролируют два раза в неделю и, достигнув слияния, трансфектируют электропорацией. Интеграция генов, экспрессия, секреция белка и функция были подтверждены qPCR, WB, ELISA, иммунофлуоресценцией и функциональными анализами. В зависимости от вида, 30 000-5 миллионов (RPE) и 10 000-1,5 миллиона (IPE) клеток могут быть выделены на глаз. Генетически модифицированные клетки демонстрируют значительную сверхэкспрессию PEDF / GM-CSF со способностью уменьшать окислительный стресс и предлагают гибкую систему для анализа ex vivo и исследований in vivo, переносимых на людей для разработки подходов к окулярной генной терапии.

Introduction

Наша группа фокусируется на разработке регенеративных подходов к лечению нейроретинальной дегенерации, то есть ВМД, с помощью невирусной генной терапии на основе RPE и IPE. Доклиническая разработка таких методов лечения требует моделей in vitro, переносимых на людей. Таким образом, целью исследования, представленного здесь, является предоставление протоколов для выделения, культивировать и генной инженерии первичных клеток RPE и IPE. Обоснованием установления выделения ПЭ-клеток из нескольких видов является надежное подтверждение безопасности и эффективности подхода и повышение его воспроизводимости и переносимости. Доступная человеческая линия клеток RPE-19 отличается от первичных клеток (например, они менее пигментированы) и, следовательно, имеет лишь ограниченное значение для доклинических анализов^1. Кроме того, клетки млекопитающих, не являющиеся клетками человека, могут быть приобретены за меньшие деньги и в больших количествах; Донорскую ткань человека можно получить из различных глазных банков, но доступность ограничена и дорога. Наконец, новые лекарственные средства передовой терапии (ATMP, то есть клеточный, тканевый или лекарственный препарат генной терапии) должны быть применены по крайней мере у двух разных видов перед тестированием на пациентах, и эти исследования in vivo запрашивают подготовку аллогенных клеточных трансплантатов.

Нейродегенеративные заболевания сетчатки являются основной причиной слепоты в промышленно развитых странах, включая распространенные заболевания, такие как ВМД, а также редкие заболевания, такие как пигментный ретинит, при котором гибель клеток сетчатки в конечном итоге приводит к слепоте. Повреждение клеток RPE, фоторецепторов и ганглиозных клеток сетчатки (RGC) в некоторых случаях может быть замедлено, но в настоящее время нет доступных лечебных методов лечения. ATMP предлагают потенциал для коррекции дефектов генов, интеграции терапевтических генов или замены дегенерированных клеток, тем самым позволяя разработать регенеративные и лечебные методы лечения таких заболеваний, как ВМД; 13 генных терапий уже получили одобрение маркетинга, включая терапию для лечения мутационно-ассоциированной дегенерации сетчатки RPE65^2,3. Среди пожилых людей (>60 лет) ~ 30 миллионов человек во всем мире страдают либо неоваскулярной (nvAMD), либо аваскулярной (aAMD) AMD^4. Обе формы индуцируются возрастными триггерами, включая окислительное повреждение, нарушение функции и потерю клеток RPE с последующей деградацией фоторецепторов, среди прочего (например, аллели генетического риска, курение, гипертония)^5,6. При nvAMD патогенез усугубляется дисбалансом ангиогенных и антиангиогенных факторов в пользу ангиогенного фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), индуцируемого хориоидальной неоваскуляризацией (CNV). На сегодняшний день только нвАМД поддается лечению ежемесячными интравитреальными инъекциями ингибиторов белка VEGF для подавления ЦНВ; эффективного лечения для aAMD^6,7пока нет.

В нескольких исследованиях оценивали клеточную терапию для замены анти-VEGF терапии: исследования, проведенные Binder et al., в которых свежесобранные аутологичные клетки RPE были пересажены пациентам с nAMD^8,9,10,показали умеренное улучшение зрения, но только небольшая группа пациентов достигла окончательной остроты зрения, достаточно высокой, чтобы позволить чтение. Недавно в клиническом исследовании фазы I использовался пластырь RPE, полученный из эмбриональных стволовых клеток, для лечения ВМД с многообещающими результатами; т.е. эффективность, стабильность и безопасность пластыря RPE в течение 12 месяцев у 2 из 10 пациентов, получавших^{лечение 11.} Кроме того, несколько групп опубликовали исследования, в которых аутологичные мембранно-сосудисто-хороидные пятна RPE-Bruch были собраны из периферической сетчатки и пересажены в макулу^12,13,14; и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), полученные из RPE, были сгенерированы для трансплантации^15. Для aAMD антитела, нацеленные на путь комплемента, были протестированы в клинических испытаниях^6,16, а исследование фазы I с использованием одной интравитреальной инъекции аденоациированного вирусного (AAV) вектора, кодировающего ген фактора CD59 (AAVCAGsCD59) у пациентов с географической атрофией (GA), было завершено^17; недавно начато исследование фазы II, целью которого является набор 132 пациентов с прогрессирующим aAMD и оценка результата через 2 года после вмешательства^18. Наконец, исследовательская группа FocuS начала многоцентровое клиническое исследование фазы I / II, оценивающее безопасность, реакцию на дозу и эффективность рекомбинантного нереплицируемого вектора AAV, кодировающего фактор комплемента человека^19.

В первую очередь, целью регенеративной терапии ВМД является трансплантация функциональных RPE-клеток, которые были повреждены или потеряны. Однако клетки IPE и RPE имеют много функциональных и генетических сходств (например, фагоцитоз и метаболизм ретинола), и поскольку клетки IPE более реально собираются, они были предложены в качестве заменителя RPE^20. Несмотря на то, что ранее было продемонстрировано, что трансплантация клеток IPE задерживает дегенерацию фоторецепторов на животных моделях^21,22 и стабилизирует зрительную функцию у пациентов с конечной стадией nvAMD, у этих пациентов²³не наблюдалось значительного улучшения. Отсутствие эффективности может быть связано с низким количеством трансплантированных клеток и/или дисбалансом нейропротекторных факторов сетчатки. Альтернативным подходом будет трансплантация трансфектированных пигментных эпителиальных клеток, которые чрезмерно экспрессируют нейропротекторные факторы для восстановления гомеостаза сетчатки, поддержания оставшихся клеток RPE и защиты фоторецепторов и RGC от дегенерации. Следовательно, мы предлагаем новую терапию, которая включает в себя трансплантацию функциональных клеток RPE или IPE, которые подверглись генной инженерии для секреции нейропротекторных и антиангиогенных белков, таких как PEDF, GM-CSF или инсулиноподобные факторы роста (IGF). Преимуществом разработки и анализа данного подхода у нескольких видов вместо использования клеточной линии, только одного вида, или тканей человека, является: 1) повышенная воспроизводимость и переносимость результатов, как показали многочисленные исследования, проведенные в независимых лабораториях и различных видах^1,24,25; 2) клетки свиней или крупного рогатого лова по возможности одноразовые без жертвоприношения дополнительных животных; 3) наличие особенно свиньи и бычных клеток позволяет большим сериям испытаний давать надежные результаты; 4) знания по выделению, культивированию и генетической модификации клеток из наиболее часто используемых моделей позволяют проводить анализ in vivo у нескольких видов^{24,25,26 и,}таким образом, обеспечивают улучшенное соотношение риска и пользы для первых пролеченных пациентов; 5) гибкость представленного протокола позволяет использовать его в различных моделях и экспериментальных установках, а также для всех методов лечения на основе глазных клеток с генной инженерией и без нее. Напротив, альтернативные методы, такие как клеточные линии или ткани человека, имеют только ограниченную переносимость и / или ограниченную одноразовую способность. Клеточные линии, такие как ARPE-19, идеально подходят для предварительных экспериментов; однако низкая пигментация и высокая пролиферация значительно отличаются от первичных клеток^1. Клетки RPE и IPE, выделенные из донорской ткани человека, являются ценным источником для переносимых экспериментов in vitro; тем не менее, мы получаем человеческую ткань из американо-американского банка глаз, что означает, что этой ткани не менее двух дней (после энуклеации) и требуется длительная и дорогостоящая транспортировка, но местная донорская ткань недоступна в достаточных количествах для продуктивного исследования. Преимущество использования первичных клеток подтверждается многочисленными исследованиями из других групп^27,28.

Для разработки клеточной невирусной генной терапии с использованием транспозонной системы SB100X для трансфекции первичных RPE и IPE клеток с генами, кодирующими PEDF и/или GM-CSF для лечения nvAMD и aAMD, соответственно^29,30,31,32,мы впервые установили трансфекцию клеток ARPE-19¹ . Затем протоколы выделения и трансфекции были установлены в легкодоступных первичных клетках крупного рогатого голова и свиней. Теперь установлена изоляция и трансфекция первичных клеток RPE и IPE от пяти различных видов, от мелких (как мыши) до крупных млекопитающих (как крупный рогатый скот). Это было подтверждено в первичных RPE и IPE клетках, полученных из донорских глаз человека^30. Производство ATMP, соответствующее надлежащей производственной практике (GMP), было подтверждено с использованием донорской ткани человека, а также^33. Наконец, как безопасность, так и эффективность подхода оценивались in vivo у трех различных видов, для которых протокол был адаптирован: мыши, крысы и кролика. В клинической установке биопсия радужной оболочки будет собрана у пациента, и клетки IPE будут изолированы и трансфекционированы в чистой комнате, прежде чем клетки будут пересажены субретинально обратно тому же пациенту. Весь процесс будет проходить в течение одного хирургического сеанса, который длится примерно 60 минут. Разработка подхода к лечению и оценка его эффективности потребовали отличных моделей in vitro и ex vivo для реализации надежных и эффективных методов доставки генов, анализа эффективности доставки генов, терапевтической продукции белка и нейропротекторных эффектов, а также для производства клеточных трансплантатов для тестирования подхода in vivo^{1,24,25,29,30} . Стоит отметить, что терапия имеет этическое одобрение для клинической фазы ib / IIa исследования от этической комиссии по исследованиям кантона Женева (No 2019-00250), и в настоящее время последние доклинические данные, запрошенные для разрешения швейцарскими регулирующими органами, собираются с использованием представленного протокола. В связи с этим доклинические данные in vivo продемонстрировали значительное снижение ХНВ и отличную безопасность^24,25,31.

Здесь описано выделение и культивирование клеток RPE/IPE из крупного рогатого готья, свиньи, кролика, крысы и мыши, а также использование интегративной транспозонной системы SB100X в сочетании с электропорацией в качестве эффективного метода доставки генов. В частности, первичные ПЭ-клетки были трансфектрифицировались для сверхэкспрессии PEDF и GM-CSF. Сбор этих протоколов позволяет проводить исследования in vitro и in vivo на всех доклинических фазах развития АТМП. Кроме того, установка может быть адаптирована к другим генам, представляющим интерес, и заболеваниям.

Protocol

Протоколы, в которых участвовали животные, были выполнены сертифицированным персоналом и после получения разрешения кантонального департамента по защите порядка, безопасности и здоровья (DSES), Домена экспериментации животных Женевы, Швейцария, и в соответствии с Заявлением ARVO об испол…

Representative Results

Выделение ПЭ из различных видов млекопитающихИспользуя вышеупомянутые протоколы, клетки IPE и RPE были успешно выделены и культивированы из пяти различных видов. Количество клеток, получаемых в результате каждой процедуры, зависит от вида и размера глаза(табл. 1). Как ?…

Discussion

Наличие стандартизированных методов выделения и культивирования клеток ПЭ имеет основополагающее значение для разработки новых подходов к терапии дегенеративных заболеваний сетчатки. С помощью представленных здесь протоколов ПЭ-клетки можно успешно выделять из разных видов и куль?…

Materials

12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)