Isolement, culture et génie génétique de cellules épithéliales pigmentaires primaires de mammifères pour la thérapie génique non virale

Summary

Ici, un protocole pour isoler et transfecter les cellules épithéliales pigmentaires primaires de l’iris et de la rétine de divers mammifères (souris, rats, lapins, porcs et bovins) est présenté. La méthode est parfaitement adaptée à l’étude des approches de thérapie génique oculaire dans diverses configurations pour des analyses ex vivo et des études in vivo transférables à l’homme.

Abstract

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est la cause la plus fréquente de cécité chez les patients >60 ans, affectant environ 30 millions de personnes dans le monde. La DMLA est une maladie multifactorielle influencée par des facteurs environnementaux et génétiques, qui entraînent une altération fonctionnelle de la rétine due à la dégénérescence des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) suivie d’une dégradation des photorécepteurs. Un traitement idéal comprendrait la transplantation de cellules RPE saines sécrant des facteurs neuroprotecteurs pour prévenir la mort cellulaire RPE et la dégénérescence des photorécepteurs. En raison des similitudes fonctionnelles et génétiques et de la possibilité d’une biopsie moins invasive, la transplantation de cellules épithéliales pigmentaires de l’iris (EPI) a été proposée comme substitut à l’EPR dégénérée. La sécrétion de facteurs neuroprotecteurs par un faible nombre de cellules transplantées sous-rétinales peut être obtenue par transfection à médiation transposonée par la Belle au bois dormant (SB100X)avec des gènes codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) et / ou le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF). Nous avons établi l’isolement, la culture et la transfection médiée par SB100Xdes cellules RPE et IPE de diverses espèces, y compris les rongeurs, les porcs et les bovins. Les globes sont explantés et la cornée et le cristallin sont enlevés pour accéder à l’iris et à la rétine. À l’aide d’une spatule sur mesure, les cellules IPE sont retirées de l’iris isolé. Pour récolter des cellules EPR, une incubation de trypsine peut être nécessaire, selon l’espèce. Ensuite, à l’aide d’une spatule personnalisée RPE, les cellules sont suspendues dans un milieu. Après l’ensemencement, les cellules sont surveillées deux fois par semaine et, après avoir atteint la confluence, transfectées par électroporation. L’intégration, l’expression, la sécrétion et la fonction des protéines ont été confirmées par qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence et tests fonctionnels. Selon les espèces, 30 000 à 5 millions de cellules (EPR) et 10 000 à 1,5 million de cellules (IPE) peuvent être isolées par œil. Les cellules génétiquement modifiées présentent une surexpression significative du PEDF/GM-CSF avec la capacité de réduire le stress oxydatif et offrent un système flexible pour les analyses ex vivo et les études in vivo transférables à l’homme pour développer des approches de thérapie génique oculaire.

Introduction

Notre groupe se concentre sur le développement d’approches régénératives pour traiter la dégénérescence neurorétinienne, c’est-à-dire la DMLA, par thérapie génique non virale basée sur l’EPR et l’IPE. L’établissement préclinique de telles thérapies nécessite des modèles in vitro transférables à l’homme. Ainsi, l’objectif de l’étude présentée ici est de fournir des protocoles pour l’isolement, la culture et le génie génétique des cellules PRIMAIRES RPE et IPE. La raison d’être de l’isolement des cellules PE de plusieurs espèces est de confirmer de manière robuste l’innocuité et l’efficacité de l’approche et d’accroître sa reproductibilité et sa transférabilité. La lignée cellulaire ARPE-19 humaine disponible diffère des cellules primaires (par exemple, elles sont moins pigmentées) et n’a donc qu’une valeur limitée pour les analyses précliniques¹. De plus, les cellules de mammifères non humains peuvent être achetées à moindre coût et en plus grandes quantités; les tissus de donneurs humains peuvent être obtenus à partir de diverses banques d’yeux, mais la disponibilité est limitée et coûteuse. Enfin, les nouveaux médicaments de thérapie innovante (ATMP, c’est-à-dire les cellules, les tissus ou les médicaments de thérapie génique) doivent être appliqués à au moins deux espèces différentes avant d’être testés chez les patients et ces études in vivo demandent la préparation de greffes de cellules allogéniques.

Les maladies neurodégénératives de la rétine sont la principale cause de cécité dans les pays industrialisés, comprenant des maladies courantes comme la DMLA, ainsi que des maladies rares comme la rétinite pigmentaire, dans laquelle la mort cellulaire rétinienne conduit finalement à la cécité. Les lésions des cellules EPR, des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) peuvent dans certains cas être ralenties, mais il n’existe actuellement aucun traitement curatif. Les ATMP offrent la possibilité de corriger les défauts génétiques, d’intégrer des gènes thérapeutiques ou de remplacer les cellules dégénérées, permettant ainsi le développement de thérapies régénératives et curatives pour des maladies telles que la DMLA; 13 thérapies géniques ont déjà obtenu l’autorisation de commercialisation, y compris une thérapie pour traiter la dégénérescence rétinienne associée à la mutation RPE65^2,3. Parmi les personnes âgées (>60 ans), environ 30 millions de personnes dans le monde sont touchées par la DMLA néovasculaire (nvAMD) ou avasculaire (aAMD)^4. Les deux formes sont induites par des déclencheurs associés à l’âge, y compris des dommages oxydatifs, une altération de la fonction et une perte de cellules EPR suivies d’une dégradation des photorécepteurs, entre autres (par exemple, allèles de risque génétique, tabagisme, hypertension)^5,6. Dans la nvAMD, la pathogenèse est aggravée par un déséquilibre des facteurs angiogéniques et anti-angiogéniques en faveur du facteur de croissance endothélial vasculaire angiogénique (VEGF) qui induit la néovascularisation choroïdienne (CNV). À ce jour, seule la nvAMD peut être traité par des injections intravitréennes mensuelles d’inhibiteurs de la protéine VEGF pour supprimer le CNV; aucun traitement efficace n’est encore disponible pour^{l’AAMD 6,7}.

Plusieurs études ont évalué les thérapies cellulaires pour remplacer le traitement anti-VEGF: des études réalisées par Binder et al., dans lesquelles des cellules RPE autologues fraîchement récoltées ont été transplantées chez des patients atteints de nAMD^8,9,10, ont montré une amélioration visuelle modérée, mais seul un petit groupe de patients a atteint une acuité visuelle finale suffisamment élevée pour permettre la lecture. Récemment, une étude clinique de phase I a utilisé un patch RPE dérivé de cellules souches embryonnaires pour traiter la DMLA avec des résultats prometteurs; c’est-à-dire l’efficacité, la stabilité et l’innocuité du timbre RPE jusqu’à 12 mois chez 2 des 10 patients traités^11. En outre, plusieurs groupes ont publié des études dans lesquelles des plaques autologues de la membrane-choroïde de BRUCH ont été récoltées dans la rétine périphérique et transplantées dans la macula^12,13,14; et des patchs d’EPR induits dérivés de cellules souches pluripotentes (iPSC) ont été générés pour la transplantation¹⁵. Pour l’aAMD, des anticorps ciblant la voie du complément ont été testés dans les essais cliniques^6,16 et une étude de phase I utilisant une seule injection intravitréenne d’un vecteur viral adéno-associé (AAV) codant le gène du facteur CD59 (AAVCAGsCD59) chez des patients atteints d’atrophie géographique (GA) a été réalisée¹⁷; l’étude de phase II a récemment débuté et vise à recruter 132 patients atteints de DMA avancée et à évaluer le résultat à 2 ans après l’intervention^18. Enfin, le groupe d’étude FocuS a entamé un essai clinique multicentrique de phase I/II évaluant l’innocuité, la dose-réponse et l’efficacité d’un vecteur AAV recombinant non répliquant codé pour un facteur de complément humain^19.

Principalement, l’objectif d’une thérapie régénérative de la DMLA est la transplantation de cellules RPE fonctionnelles, qui ont été endommagées ou perdues. Cependant, les cellules IPE et RPE partagent de nombreuses similitudes fonctionnelles et génétiques (par exemple, la phagocytose et le métabolisme du rétinol), et comme les cellules IPE sont plus facilement récoltées, elles ont été proposées comme substitut RPE²⁰. Même s’il a déjà été démontré que la greffe de cellules IPE retarde la dégénérescence des photorécepteurs dans les modèles animaux^21,22 et stabilise la fonction visuelle chez les patients atteints de nvAMD en phase finale, aucune amélioration significative n’a été observée chez ces patients²³. Le manque d’efficacité peut être dû au faible nombre de cellules transplantées et/ou au déséquilibre des facteurs rétiniens neuroprotecteurs. Une autre approche consisterait à transplanter des cellules épithéliales pigmentaires transfectées qui surexpriment les facteurs neuroprotecteurs pour restaurer l’homéostasie rétinienne, maintenir les cellules EPR restantes et protéger les photorécepteurs et les CRG de la dégénérescence. Par conséquent, nous proposons une nouvelle thérapie qui comprend la transplantation de cellules RPE ou IPE fonctionnelles qui ont subi un génie génétique pour sécrétiser des protéines neuroprotectrices et anti-angiogéniques, telles que le PEDF, le GM-CSF ou les facteurs de croissance analogues à l’insuline (IGF). L’avantage de développer et d’analyser cette approche chez plusieurs espèces au lieu d’utiliser une lignée cellulaire, une seule espèce, ou un tissu humain est : 1) une reproductibilité et une transférabilité accrues des résultats comme le montrent de nombreuses études réalisées dans des laboratoires indépendants et différentes espèces^1,24,25; 2) les cellules de porc ou de bovin sont jetables sans le sacrifice d’animaux supplémentaires; 3) la disponibilité de cellules de porc et de bovins en particulier permet à de grandes séries d’essais de produire des résultats robustes; 4) la connaissance de l’isolement, de la culture et de la modification génétique des cellules à partir des modèles les plus utilisés permet des analyses in vivo chez plusieurs espèces^24,25,26 et offre ainsi un meilleur rapport bénéfice-risque pour les premiers patients traités; 5) la flexibilité du protocole présenté permet son utilisation dans divers modèles et dispositifs expérimentaux et pour toutes les thérapies à base de cellules oculaires avec et sans génie génétique. En revanche, les techniques alternatives telles que les lignées cellulaires ou les tissus humains ne sont que d’une transférabilité limitée et/ou d’une jetabilité limitée. Les lignées cellulaires telles que l’ARPE-19 sont idéales pour les expériences préliminaires; cependant, une faible pigmentation et une prolifération élevée diffèrent significativement des cellules primaires¹. Les cellules RPE et IPE, qui sont isolées à partir de tissus de donneurs humains, constituent une source précieuse pour des expériences in vitro transférables; cependant, nous obtenons du tissu humain auprès d’une banque d’yeux américano-américaine, ce qui signifie que le tissu a au moins deux jours (après l’énucléation) et nécessite un transport long et coûteux, mais que le tissu du donneur local n’est pas disponible en quantité suffisante pour une recherche productive. L’avantage de l’utilisation de cellules primaires est confirmé par de multiples études d’autres groupes^27,28.

Pour le développement d’une thérapie génique non virale à base de cellules utilisant le système de transposon SB100X pour transfecter les cellules RPE et IPE primaires avec les gènes codant pour PEDF et / ou GM-CSF pour traiter nvAMD et aAMD, respectivement^29,30,31,32, nous avons d’abord établi la transfection des cellules ARPE-19¹ . Ensuite, les protocoles d’isolement et de transfection ont été établis dans des cellules primaires bovines et porcines facilement accessibles. Maintenant, l’isolement et la transfection des cellules primaires RPE et IPE de cinq espèces différentes ont été établis, des petits (comme la souris) aux grands mammifères (comme le bétail). Elle a été confirmée dans des cellules primaires RPE et IPE dérivées d’yeux de donneurs humains³⁰. La production conforme aux Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) de l’ATMP a également été validée à l’aide de tissus de donneurs^{humains 33.} Enfin, l’innocuité et l’efficacité de l’approche ont été évaluées in vivo chez trois espèces différentes pour lesquelles le protocole a été adapté : la souris, le rat et le lapin. Dans la configuration clinique, une biopsie de l’iris sera prélevée sur le patient et les cellules IPE seront isolées et transfectées dans la salle blanche, avant que les cellules ne soient transplantées par voie sous-rétinale chez le même patient. L’ensemble du processus aura lieu au cours d’une seule séance chirurgicale d’une durée d’environ 60 minutes. Le développement de l’approche thérapeutique et l’évaluation de son efficacité ont demandé d’excellents modèles in vitro et ex vivo pour mettre en œuvre des méthodes d’administration de gènes robustes et efficaces, pour analyser l’efficacité de l’administration de gènes, la production de protéines thérapeutiques et les effets neuroprotecteurs, et pour produire des greffes de cellules pour tester^l’approche in vivo^1,24, 25^,29,30 . Il convient de mentionner que la thérapie a l’approbation éthique pour un essai clinique de phase Ib/IIa de la commission éthique pour la recherche du canton de Genève (n° 2019-00250) et que les dernières données précliniques actuellement demandées pour autorisation par les autorités réglementaires suisses sont collectées à l’aide du protocole présenté. À cet égard, les données précliniques in vivo ont démontré une réduction significative de la CNV et une excellente sécurité^24,25,31.

Ici, l’isolement et la culture de cellules RPE/IPE de bovins, de porcs, de lapins, de rats et de souris, ainsi que l’utilisation du système de transposition intégratif SB100X combiné à l’électroporation comme méthode efficace d’administration de gènes sont décrits. En particulier, les cellules PE primaires ont été transfectées pour surexprimer le PEDF et le GM-CSF. La collecte de ces protocoles permet de réalisées dans toutes les phases précliniques du développement de l’ATMP. De plus, la configuration a le potentiel d’être adaptée à d’autres gènes d’intérêt et maladies.

Protocol

Les protocoles dans lesquels les animaux ont été impliqués ont été réalisés par du personnel certifié et après autorisation du Département cantonal de la sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale de Genève, Suisse, et conformément à la Déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle (approbation no. GE/94/17). Des rats bruns de Norvège adultes en bonne santé, des souris C57BL/6 et des lapins blancs néo-zél…

Representative Results

Isolement de l’EP de différentes espèces de mammifèresEn utilisant les protocoles susmentionnés, les cellules IPE et RPE ont été isolées et cultivées avec succès à partir de cinq espèces différentes. Le nombre de cellules obtenues à partir de chaque procédure dépend de l’espèce et de la taille de l’œil (Tableau 1). Comme le montre la figure 1,les cellules présentent une morphologie et une pigmentation typiques des cellules PE (à …

Discussion

Avoir des méthodes normalisées pour isoler et mettre en culture des cellules PE est fondamental dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies dégénératives de la rétine. Avec les protocoles présentés ici, les cellules PE peuvent être isolées avec succès de différentes espèces et cultivées pendant de longues périodes (jusqu’à présent, la culture la plus longue était maintenue pendant 2 ans^1,38); la morphologie,…

Materials

12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)