Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Transinfektion primärer Iris- und retinaler Pigmentepithelzellen aus verschiedenen Säugetieren (Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schweine und Rinder) vorgestellt. Die Methode eignet sich ideal, um okuläre Gentherapieansätze in verschiedenen Setups für Ex-vivo-Analysen und auf den Menschen übertragbare In-vivo-Studien zu untersuchen.

Abstract

Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für Erblindung bei Patienten >60 Jahren und betrifft weltweit ~ 30 Millionen Menschen. AMD ist eine multifaktorielle Erkrankung, die von Umwelt- und genetischen Faktoren beeinflusst wird, die aufgrund einer degeneration retinaler Pigmentepithelzellen (RPE) mit anschließendem Abbau des Photorezeptors zu einer funktionellen Beeinträchtigung der Netzhaut führen. Eine ideale Behandlung wäre die Transplantation gesunder RPE-Zellen, die neuroprotektive Faktoren sezernieren, um den RPE-Zelltod und die Degeneration des Photorezeptors zu verhindern. Aufgrund der funktionellen und genetischen Ähnlichkeiten und der Möglichkeit einer weniger invasiven Biopsie wurde die Transplantation von Irispigmentepithelzellen (IPE) als Ersatz für die degenerierte RPE vorgeschlagen. Die Sekretion neuroprotektiver Faktoren durch eine geringe Anzahl subretinal transplantierter Zellen kann durch transpononvermittelte Transfektion von Dornröschen (SB100X) mit Genen erreicht werden, die für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) und/oder den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) kodieren. Wir etablierten die Isolierung, Kultur und SB100X-vermittelteTransfektion von RPE- und IPE-Zellen verschiedener Spezies, darunter Nagetiere, Schweine und Rinder. Globen werden explantiert und die Hornhaut und linse werden entfernt, um Zugang zur Iris und zur Netzhaut zu erhalten. Mit einem speziell angefertigten Spatel werden IPE-Zellen aus der isolierten Iris entfernt. Um RPE-Zellen zu ernten, kann je nach Art eine Trypsin-Inkubation erforderlich sein. Dann werden die Zellen mit RPE-angepasstem Spatel im Medium suspendiert. Nach der Aussaat werden die Zellen zweimal pro Woche überwacht und nach Erreichen des Zusammenflusses durch Elektroporation transfiziert. Genintegration, Expression, Proteinsekretion und -funktion wurden durch qPCR, WB, ELISA, Immunfluoreszenz und funktionelle Assays bestätigt. Je nach Art können pro Auge 30.000-5 Millionen (RPE) und 10.000-1,5 Millionen (IPE) Zellen isoliert werden. Genetisch veränderte Zellen zeigen eine signifikante PEDF/GM-CSF-Überexpression mit der Fähigkeit, oxidativen Stress zu reduzieren, und bieten ein flexibles System für Ex-vivo-Analysen und In-vivo-Studien, die auf den Menschen übertragbar sind, um okuläre Gentherapieansätze zu entwickeln.

Introduction

Unsere Gruppe konzentriert sich auf die Entwicklung regenerativer Ansätze zur Behandlung der neuroretinalen Degeneration, d.h. AMD, durch RPE- und IPE-basierte nicht-virale Gentherapie. Die präklinische Etablierung solcher Therapien erfordert auf den Menschen übertragbare In-vitro-Modelle. Ziel der hier vorgestellten Studie ist es daher, Protokolle für die Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären RPE- und IPE-Zellen bereitzustellen. Die Begründung für die Isolierung von PE-Zellen aus mehreren Spezies besteht darin, die Sicherheit und Effizienz des Ansatzes robust zu bestätigen und seine Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit zu erhöhen. Die verfügbare humane RPE-Zelllinie ARPE-19 unterscheidet sich von Primärzellen (z.B. sind sie weniger pigmentiert) und ist daher für präklinische Analysen nur von begrenztem Wert¹. Darüber hinaus können nicht-menschliche Säugetierzellen für weniger Kosten und in größeren Mengen gekauft werden; menschliches Spendergewebe kann aus verschiedenen Augenbanken bezogen werden, aber die Verfügbarkeit ist begrenzt und teuer. Schließlich müssen neue Arzneimittel für neuartige Therapien (ATMP, d. h. Zell-, Gewebe- oder Gentherapeutikum) in mindestens zwei verschiedenen Spezies angewendet werden, bevor sie an Patienten getestet werden, und diese In-vivo-Studien erfordern die Vorbereitung allogener Zelltransplantate.

Retinale neurodegenerative Erkrankungen sind die Hauptursache für Blindheit in Industrieländern und umfassen häufige Erkrankungen wie AMD sowie seltene Krankheiten wie Retinitis pigmentosa, bei denen der retinale Zelltod schließlich zur Erblindung führt. RPE-Zellen, Photorezeptoren und retinale Ganglienzellen (RGC) können in einigen Fällen verlangsamt werden, aber es gibt derzeit keine kurativen Therapien. ATMPs bieten das Potenzial, Gendefekte zu korrigieren, therapeutische Gene zu integrieren oder degenerierte Zellen zu ersetzen, wodurch die Entwicklung regenerativer und kurativer Therapien für Krankheiten wie AMD ermöglicht wird; 13 Gentherapien haben bereits die Marktzulassung erhalten, darunter eine Therapie zur Behandlung der RPE65-Mutation-assoziierten Netzhautdegeneration^2,3. Unter den älteren Erwachsenen (>60 Jahre) sind weltweit ~ 30 Millionen Menschen entweder von neovaskulärer (nvAMD) oder avaskulärer (aAMD) AMD⁴betroffen. Beide Formen werden durch altersbedingte Auslöser induziert, darunter oxidative Schäden, Funktionsstörungen und Verlust von RPE-Zellen, gefolgt von einem Photorezeptorabbau, unter anderem (z. B. genetische Risikoallele, Rauchen, Bluthochdruck)^5,6. Bei nvAMD wird die Pathogenese durch ein Ungleichgewicht von angiogenen und anti-angiogenen Faktoren zugunsten des angiogenen Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) verschlimmert, der die choroidale Neovaskularisation (CNV) induziert. Bisher ist nur nvAMD durch monatliche intravitreale Injektionen von Inhibitoren des VEGF-Proteins behandelbar, um das CNV zu unterdrücken; für aAMD^6,7ist noch keine wirksame Behandlung verfügbar.

Mehrere Studien evaluierten zellbasierte Therapien, um die Anti-VEGF-Therapie zu ersetzen: Studien von Binder et al., in denen frisch geerntete autologe RPE-Zellen in Patienten mit nAMD 8^,9,10transplantiert wurden, zeigten eine moderate visuelle Verbesserung, aber nur eine kleine Gruppe von Patienten erreichte eine endgültige Sehschärfe, die hoch genug war, um das Lesen zu ermöglichen. Kürzlich verwendete eine klinische Phase-I-Studie ein aus embryonalen Stammzellen gewonnenes RPE-Pflaster zur Behandlung von AMD mit vielversprechenden Ergebnissen; d. h. Wirksamkeit, Stabilität und Sicherheit des RPE-Pflasters für bis zu 12 Monate bei 2 der 10 behandelten Patienten¹¹. Darüber hinaus haben mehrere Gruppen Studien veröffentlicht, in denen autologe RPE-Bruch-Membran-Aderhaut-Flecken aus der peripheren Netzhaut entnommen und in die Makula transplantiert wurden^12,13,14; und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete RPE-Pflaster wurden für die Transplantation erzeugt¹⁵. Für aAMD wurden Antikörper, die auf den Komplementweg abzielen, in den klinischen Studien^6,16 getestet und eine Phase-I-Studie unter Verwendung einer einzigen intravitrealen Injektion eines adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektors, der das Gen für den Faktor CD59 (AAVCAGsCD59) bei Patienten mit geografischer Atrophie (GA) kodiert, wurde abgeschlossen¹⁷; Die Kürzlich gestartete Phase-II-Studie zielt darauf ab, 132 Patienten mit fortgeschrittener aAMD zu rekrutieren und das Ergebnis 2 Jahre nach der Intervention zu bewerten¹⁸. Schließlich hat die FocuS-Studiengruppe eine multizentrische klinische Phase-I/II-Studie gestartet, in der die Sicherheit, das Dosis-Wirkungs-Verhältnis und die Wirksamkeit eines rekombinanten, nicht replizierenden AAV-Vektors untersucht wurden, der für einen menschlichen Komplementfaktor¹⁹kodiert.

Das Ziel einer regenerativen AMD-Therapie ist in erster Linie die Transplantation von funktionellen RPE-Zellen, die beschädigt wurden oder verloren gegangen sind. IPE- und RPE-Zellen teilen jedoch viele funktionelle und genetische Ähnlichkeiten (z. B. Phagozytose und Retinolstoffwechsel), und da IPE-Zellen besser geerntet werden können, wurden sie als RPE-Ersatz vorgeschlagen²⁰. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass die IPE-Zelltransplantation die Photorezeptordegeneration in den Tiermodellen^21,22 verzögert und die Sehfunktion bei Patienten mit nvAMD im Endstadium stabilisiert, wurde bei diesen Patienten keine signifikante Verbesserung beobachtet²³. Der Mangel an Wirksamkeit kann auf die geringe Anzahl transplantierter Zellen und / oder das Ungleichgewicht neuroprotektiver Netzhautfaktoren zurückzuführen sein. Ein alternativer Ansatz wäre die Transplantation von transfizierten Pigmentepithelzellen, die neuroprotektive Faktoren überexprimieren, um die retinale Homöostase wiederherzustellen, verbleibende RPE-Zellen aufrechtzuerhalten und Photorezeptoren und RGCs vor Degeneration zu schützen. Daher schlagen wir eine neue Therapie vor, die die Transplantation von funktionellen RPE- oder IPE-Zellen umfasst, die gentechnikalisiert wurden, um neuroprotektive und antiangiogene Proteine wie PEDF, GM-CSF oder insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs) abzusondern. Der Vorteil der Entwicklung und Analyse dieses Ansatzes in mehreren Spezies anstelle einer Zelllinie, nur einer Spezies oder menschlichem Gewebe ist: 1) erhöhte Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit der Ergebnisse, wie zahlreiche Studien in unabhängigen Labors und verschiedenen Spezies zeigen^1,24,25; 2) Schweine- oder Rinderzellen sind ohne die Opfer zusätzlicher Tiere möglicherweise wegwerfbar; 3) Die Verfügbarkeit insbesondere von Schweine- und Rinderzellen ermöglicht große Versuchsreihen, um robuste Ergebnisse zu erzielen; 4) das Wissen, Zellen aus den am häufigsten verwendeten Modellen zu isolieren, zu kultivieren und genetisch zu verändern, ermöglicht In-vivo-Analysen bei mehreren Spezies^24,25,26 und bietet somit ein verbessertes Nutzen-Risiko-Verhältnis für die ersten behandelten Patienten; 5) Die Flexibilität des vorgestellten Protokolls ermöglicht den Einsatz in verschiedenen Modellen und Versuchsanordnungen sowie für alle augenzellbasierten Therapien mit und ohne Gentechnik. Im Gegensatz dazu sind alternative Techniken wie Zelllinien oder menschliches Gewebe nur von begrenzter Übertragbarkeit und/oder begrenzter Verfügbarkeit. Zelllinien wie die ARPE-19 sind ideal für Vorversuche; Niedrige Pigmentierung und hohe Proliferation unterscheiden sich jedoch signifikant von Primärzellen¹. RPE- und IPE-Zellen, die aus menschlichem Spendergewebe isoliert werden, bieten eine wertvolle Quelle für übertragbare In-vitro-Experimente; Wir beziehen jedoch menschliches Gewebe aus einer US-amerikanischen Augenbank, was bedeutet, dass das Gewebe mindestens zwei Tage alt ist (nach Enukleation) und einen langen und teuren Transport erfordert, aber lokales Spendergewebe nicht in ausreichenden Mengen für eine produktive Forschung zur Verfügung steht. Der Vorteil der Verwendung von Primärzellen wird durch mehrere Studien aus anderen Gruppen^27,28bestätigt.

Für die Entwicklung einer zellbasierten nicht-viralen Gentherapie unter Verwendung des SB100X-Transposon-Systems zur Transfizierung primärer RPE- und IPE-Zellen mit den Genen, die für PEDF und/oder GM-CSF kodieren, zur Behandlung von nvAMD bzw. aAMD^29,30,31,32, haben wir zunächst die Transfektion von ARPE-19-Zellen etabliert¹ . Als nächstes wurden die Isolations- und Transfektionsprotokolle in leicht zugänglichen Primärzellen von Rindern und Schweinen etabliert. Jetzt wurde die Isolierung und Transfektion von primären RPE- und IPE-Zellen aus fünf verschiedenen Arten etabliert, von kleinen (als Maus) bis zu großen Säugetieren (als Rinder). Es wurde in primären RPE- und IPE-Zellen aus menschlichen Spenderaugen bestätigt³⁰. Die GMP-konforme Produktion (Good Manufacturing Practices) des ATMP wurde ebenfalls unter Verwendung von menschlichem Spendergewebe validiert³³. Schließlich wurden sowohl die Sicherheit als auch die Effizienz des Ansatzes in vivo bei drei verschiedenen Spezies bewertet, für die das Protokoll angepasst wurde: Maus, Ratte und Kaninchen. Im klinischen Aufbau wird eine Irisbiopsie vom Patienten geerntet und IPE-Zellen werden isoliert und im Reinraum transfiziert, bevor die Zellen subretinal in denselben Patienten zurück transplantiert werden. Der gesamte Prozess findet während einer einzigen chirurgischen Sitzung statt, die etwa 60 Minuten dauert. Die Entwicklung des Behandlungsansatzes und die Bewertung seiner Effizienz erforderten ausgezeichnete In-vitro- und Ex-vivo-Modelle, um robuste und effiziente Genliefermethoden zu implementieren, die Effizienz der Genabgabe, die therapeutische Proteinproduktion und die neuroprotektiven Wirkungen zu analysieren und Zelltransplantate zu produzieren, um den Ansatz in vivozu testen^{1,24,25,29,30} . Erwähnenswert ist, dass die Therapie von der Ethikkommission für Forschung des Kantons Genf (Nr. 2019-00250) über die ethische Genehmigung für eine klinische Phase-Ib/IIa-Studie verfügt und derzeit die letzten präklinischen Daten, die von den Schweizer Zulassungsbehörden zur Genehmigung angefordert wurden, mit dem vorgestellten Protokoll gesammelt werden. In dieser Hinsicht zeigten präklinische In-vivo-Daten eine signifikante Reduktion des CNV und eine ausgezeichnete Sicherheit^24,25,31.

Hier wird die Isolierung und Kultur von RPE/IPE-Zellen aus Rind, Schwein, Kaninchen, Ratte und Maus sowie der Einsatz des integrativen TRANSPONON-Systems SB100X in Kombination mit der Elektroporation als effiziente Gen-Delivery-Methode beschrieben. Insbesondere primäre PE-Zellen wurden transfiziert, um PEDF und GM-CSF zu überexprimieren. Die Sammlung dieser Protokolle ermöglicht die Durchführung der In-vitro- und In-vivo-Studien in allen präklinischen Phasen der ATMP-Entwicklung. Darüber hinaus hat der Aufbau das Potenzial, an andere interessante Gene und Krankheiten angepasst zu werden.

Protocol

Die Protokolle, an denen Tiere beteiligt waren, wurden von zertifiziertem Personal und nach Genehmigung durch das kantonale Département de la sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale von Genf, Schweiz, und gemäß der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung (Genehmigungs-Nr. GE/94/17). Erwachsene gesunde Braune Wanderratten, C57BL/6-Mäuse und neuseeländische weiße Kaninchen wurden durch eine Überdosis Pentobarbital (150 mg/kg), verdü…

Representative Results

PE-Isolierung aus verschiedenen SäugetierartenMit den oben genannten Protokollen wurden IPE- und RPE-Zellen erfolgreich isoliert und aus fünf verschiedenen Spezies kultiviert. Die Anzahl der Zellen, die aus jedem Verfahren gewonnen werden, hängt von der Art und Größe des Auges ab (Tabelle 1). Wie in Abbildung 1gezeigt, zeigen die Zellen eine typische PE-Zellmorphologie und Pigmentierung (mit Ausnahme der gezeigten Kaninchenzellen, die von Albino New…

Discussion

Standardisierte Methoden zur Isolierung und Kultivierung von PE-Zellen sind von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung neuer Therapieansätze für netzhautdegenerative Erkrankungen. Mit den hier vorgestellten Protokollen können PE-Zellen erfolgreich aus verschiedenen Spezies isoliert und über lange Zeiträume kultiviert werden (bisher wurde die längste Kultur 2 Jahre lang gepflegt^1,38); typische PE-Zellmorphologie, Pigmentierung und Funktion wurde beobac…

Materials

12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)