यहां, विभिन्न स्तनधारियों (चूहों, चूहा, खरगोश, सुअर और गोजातीय) से प्राथमिक आईरिस और रेटिना वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग और स्थानांतरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। विधि आदर्श रूप से पूर्व वीवो विश्लेषण के लिए विभिन्न सेट-अप में नेत्र जीन थेरेपी दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है और वीवो अध्ययन में मनुष्यों के लिए हस्तांतरणीय है।
उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएमडी) 60 साल > के रोगियों में अंधापन का सबसे लगातार कारण है, जो दुनिया भर में ~ 30 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है। एएमडी पर्यावरण और आनुवंशिक कारकों से प्रभावित एक बहुकार्यात्मक रोग है, जो रेटिना वर्णक एपिथेलियल (आरपीई) कोशिका पतन के कारण रेटिना की कार्यात्मक हानि का कारण बनता है जिसके बाद फोटोरिसेप्टर क्षरण होता है। एक आदर्श उपचार में आरपीई सेल मृत्यु और फोटोरिसेप्टर अध: पतन को रोकने के लिए न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों का स्राव करने वाली स्वस्थ आरपीई कोशिकाओं का प्रत्यारोपण शामिल होगा। कार्यात्मक और आनुवंशिक समानताओं और कम आक्रामक बायोप्सी की संभावना के कारण, आईरिस वर्णक एपिथेलियल (आईपीई) कोशिकाओं के प्रत्यारोपण को विकृत आरपीई के विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया था। कम संख्या में सबरेटिनली-प्रत्यारोपित कोशिकाओं द्वारा न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों का स्राव स्लीपिंग ब्यूटी (SB100X)ट्रांसपोसन-मध्यस्थता ट्रांसफैक्शन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें वर्णक एपिथेलियम-व्युत्पन्न कारक (पीईडीएफ) और/या ग्रेनुलोसिटे मैक्रोफेज-कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के लिए जीन कोडिंग है । हमने कृंतक, सूअर और मवेशियों सहित विभिन्न प्रजातियों से आरपीई और आईपीई कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति और SB100X-मध्यस्थताट्रांसफैक्शन की स्थापना की। ग्लोब्स को हटा दिया जाता है और आईरिस और रेटिना तक पहुंचने के लिए कॉर्निया और लेंस को हटा दिया जाता है। कस्टम-निर्मित स्पैटुला का उपयोग करके, आईपीई कोशिकाओं को अलग आईरिस से हटा दिया जाता है। आरपीई कोशिकाओं को फसल करने के लिए, प्रजातियों के आधार पर एक ट्राइपसिन इनक्यूबेशन की आवश्यकता हो सकती है। फिर, आरपीई-अनुकूलित स्पैटुला का उपयोग करके, कोशिकाओं को मध्यम में निलंबित कर दिया जाता है। सीडिंग के बाद, कोशिकाओं की प्रति सप्ताह दो बार निगरानी की जाती है और संगम तक पहुंचने के बाद, इलेक्ट्रोपाउरेशन से संक्रमित होती है। जीन एकीकरण, अभिव्यक्ति, प्रोटीन स्राव, और समारोह QPCR, पश्चिम बंगाल, एलिसा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और कार्यात्मक परख द्वारा पुष्टि की गई । प्रजातियों के आधार पर, 30,000-5 मिलियन (आरपीई) और 10,000-15 मिलियन (आईपीई) कोशिकाओं को प्रति आंख अलग किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाएं ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करने की क्षमता के साथ महत्वपूर्ण पीडीएफ/जीएम-सीएसएफ ओवरएक्सप्रेशन दिखाती हैं और पूर्व वीवो विश्लेषणों के लिए एक लचीली प्रणाली प्रदान करती हैं और वीवो अध्ययन में मनुष्यों को नेत्र जीन थेरेपी दृष्टिकोण विकसित करने के लिए अनुकूलित करती हैं ।
हमारा समूह न्यूरोरेटिनल अध: पतन, यानी एएमडी, आरपीई और आईपीई-आधारित गैर-वायरल जीन थेरेपी के इलाज के लिए पुनर्योजी दृष्टिकोणों के विकास पर ध्यान केंद्रित कर रहा है। इस तरह के उपचारों की पूर्व-नैदानिक स्थापना मनुष्यों के लिए अनुकूल विट्रो मॉडल में आवश्यक है। इस प्रकार, यहां प्रस्तुत अध्ययन का लक्ष्य प्राथमिक आरपीई और आईपीई कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति और जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करना है। कई प्रजातियों से पीई कोशिकाओं के अलगाव को स्थापित करने का तर्क दृष्टिकोण की सुरक्षा और दक्षता की मजबूती से पुष्टि करना और इसकी प्रजनन क्षमता और हस्तांतरणीयता में वृद्धि करना है। उपलब्ध मानव आरपीई सेल लाइन ARPE-19 प्राथमिक कोशिकाओं से अलग है (उदाहरण के लिए, वे कम वर्णक हैं) और इसलिए, केवल पूर्व नैदानिक विश्लेषण के लिए सीमित मूल्य का1। इसके अतिरिक्त, गैर-मानव स्तनधारी कोशिकाओं को कम लागत और बड़ी मात्रा में खरीदा जा सकता है; मानव दाता ऊतक विभिन्न नेत्र बैंकों से प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन उपलब्धता सीमित और महंगा है। अंत में, नए उन्नत थेरेपी औषधीय उत्पाद (एटएमपी, यानी, सेल, ऊतक, या जीन थेरेपी औषधीय उत्पाद) रोगियों में परीक्षण किए जाने से पहले कम से कम दो विभिन्न प्रजातियों में लागू करने की आवश्यकता होती है और ये वीवो अध्ययन में एलोजेनिक सेल प्रत्यारोपण की तैयारी का अनुरोध करते हैं।
रेटिना न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियां औद्योगिक देशों में अंधेपन का प्रमुख कारण हैं, जिसमें एएमडी जैसी सामान्य बीमारियां शामिल हैं, साथ ही रेटिनााइटिस पिगमेंटोसा जैसी दुर्लभ बीमारियां भी शामिल हैं, जिसमें रेटिना सेल डेथ अंततः अंधापन की ओर ले जाती है । आरपीई कोशिकाओं, फोटोरिसेप्टर, और रेटिना गैंगलियन कोशिकाओं (आरजीसी) क्षति कुछ मामलों में धीमा किया जा सकता है, लेकिन वर्तमान में कोई उपचारात्मक उपचार उपलब्ध हैं । एटीएमपी जीन दोषों को सही करने, चिकित्सीय जीन को एकीकृत करने या विकृत कोशिकाओं को बदलने की क्षमता प्रदान करते हैं, जिससे एएमडी जैसे रोगों के लिए पुनर्योजी और उपचारात्मक उपचारों का विकास संभव होता है; 13 जीन चिकित्सा पहले से ही RPE65 उत्परिवर्तन से जुड़े रेटिना अध: पतन2,3के इलाज के लिए एक चिकित्सा सहित विपणन अनुमोदन मिला है । पुराने वयस्कों (>60 वर्ष) में, दुनिया भर में ~ 30 मिलियन लोग या तो नियोवैस्कुलर (एनवीएएमडी) या अवस्कुलर (एएमडी) एएमडी4से प्रभावित होते हैं। दोनों रूपों को ऑक्सीडेटिव क्षति, कार्य हानि और आरपीई कोशिकाओं की हानि सहित उम्र से जुड़े ट्रिगर्स से प्रेरित किया जाता है, जिसके बाद फोटोरिसेप्टर क्षरण होता है, दूसरों के बीच (जैसे आनुवंशिक जोखिम एलील्स, धूम्रपान, उच्च रक्तचाप)5,6। एनवीएएमडी में, रोगजनकता एंजियोजेनिक और एंटी-एंजियोजेनिक कारकों के असंतुलन से बढ़ जाती है, जो एंजियोजेनिक वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीजीएफ) के पक्ष में है जो कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन (सीएनवी) को प्रेरित करता है। आज तक, सीएनवी को दबाने के लिए वीजीएफ प्रोटीन के अवरोधकों के मासिक इंट्राविएट्रियल इंजेक्शन द्वारा केवल एनवीएएमडी का इलाज किया जाता है; कोई प्रभावी उपचार अभी तक AAMD6,7के लिए उपलब्ध है .
कई अध्ययनों ने एंटी-वीजीएफ थेरेपी को बदलने के लिए सेल-आधारित उपचारों का मूल्यांकन किया: बाइंडर एट अल द्वारा किए गए अध्ययन, जिसमें ताजा-काटा गया ऑटोलॉगस आरपीई कोशिकाओं कोएनएमडी8,9,10के साथ रोगियों में प्रत्यारोपित किया गया था, मध्यम दृश्य सुधार दिखाया गया, लेकिन केवल रोगियों का एक छोटा समूह पढ़ने को सक्षम करने के लिए पर्याप्त अंतिम दृश्य तीक्ष्णता तक पहुंच गया। हाल ही में, एक चरण मैं नैदानिक अध्ययन एक भ्रूण स्टेम सेल-व्युत्पन्न आरपीई पैच का इस्तेमाल किया आशाजनक परिणामों के साथ एएमडी का इलाज; यानी, प्रभावकारिता, स्थिरता, और 10 रोगियों में से 2 में 12 महीने तक के लिए आरपीई पैच की सुरक्षा11का इलाज किया . इसके अलावा, कई समूहों ने अध्ययन प्रकाशित किए हैं जिसमें ऑटोलॉगस आरपीई-ब्रुच के झिल्ली-कोरॉइड पैच को परिधीय रेटिना से काटा गया था और मैकुला12,13, 14में प्रत्यारोपित किया गया था; और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न आरपीई पैच प्रत्यारोपण के लिए उत्पन्न किए गए थे15. AAMD के लिए, पूरक मार्ग को लक्षित एंटीबॉडी नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण किया गया है6,16 और एक चरण मैं अध्ययन एक adeno के एक इंट्राविट्रियल इंजेक्शन का उपयोग कर जुड़े वायरल (AAV) कारक CD59 के लिए जीन कोडिंग (AAVCAGsCD59) भौगोलिक शोष (GA) के साथ रोगियों में पूरा किया गया था17; चरण द्वितीय अध्ययन हाल ही में शुरू कर दिया और उन्नत aAMD के साथ 132 रोगियों की भर्ती और 2 साल के बाद हस्तक्षेप18में परिणाम का मूल्यांकन करना है . अंत में, फोक्यूएस अध्ययन समूह ने एक चरण I/II मल्टीसेंटर नैदानिक परीक्षण शुरू कर दिया है जो एक पुनर्संयोजन गैर-नकल एएवी वेक्टर की सुरक्षा, खुराक प्रतिक्रिया और प्रभावकारिता का मूल्यांकन करता है जो मानव पूरक कारक19को एन्कोडिंग करता है ।
मुख्य रूप से, एक पुनर्योजी एएमडी थेरेपी का लक्ष्य कार्यात्मक आरपीई कोशिकाओं का प्रत्यारोपण है, जो क्षतिग्रस्त या खो गए थे। हालांकि, आईपीई और आरपीई कोशिकाएं कई कार्यात्मक और आनुवंशिक समानताएं (उदाहरण के लिए, फागोसिटोसिस और रेटिनोल मेटाबोलिज्म) साझा करती हैं, और क्योंकि आईपीई कोशिकाएं अधिक व्यवहार्य हैं, उन्हें आरपीई विकल्प20के रूप में प्रस्तावित किया गया है। यद्यपि यह पहले भी प्रदर्शित किया गया है कि आईपीई सेल प्रत्यारोपण पशु मॉडल21,22 में फोटोरिसेप्टर अध: पतन में देरी करता है और अंत-चरण एनवीएएमडी वाले रोगियों में दृश्य कार्य को स्थिर करता है, इन रोगियों में कोई महत्वपूर्ण सुधार नहीं देखा गया था23। प्रभावकारिता की कमी प्रत्यारोपित कोशिकाओं की कम संख्या के कारण हो सकती है, और/या न्यूरोप्रोटेक्टिव रेटिना कारकों के असंतुलन के कारण हो सकती है । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण संक्रमित वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करना होगा जो रेटिना होमोस्टेसिस को बहाल करने, शेष आरपीई कोशिकाओं को बनाए रखने और फोटोरिसेप्टर्स और आरजीसी को पतन से बचाने के लिए न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों को अधिक जोड़ते हैं। नतीजतन, हम एक नई थेरेपी का प्रस्ताव करते हैं जिसमें कार्यात्मक आरपीई या आईपीई कोशिकाओं का प्रत्यारोपण शामिल है जो न्यूरोप्रोटेक्टिव और एंटी-एंजियोजेनिक प्रोटीन, जैसे पीडीएफ, जीएम-सीएसएफ या इंसुलिन-जैसे विकास कारकों (आईजीएफ) को स्रावित करने के लिए जेनेटिक इंजीनियरिंग से गुजरी हैं। सेल लाइन, केवल एक प्रजाति, या मानव ऊतक का उपयोग करने के बजाय कई प्रजातियों में इस दृष्टिकोण को विकसित करने और विश्लेषण करने का लाभ यह है: 1) स्वतंत्र प्रयोगशालाओं और विभिन्न प्रजातियों में महसूस किए गए कई अध्ययनों द्वारा दिखाए गए परिणामों की प्रजनन क्षमता और हस्तांतरणशीलता में वृद्धिहुई 1,24,25; 2) सुअर या गोजातीय कोशिकाओं अतिरिक्त जानवरों के बलिदान के बिना संभव डिस्पोजेबल हैं; 3) विशेष रूप से सुअर और गोजातीय कोशिकाओं की उपलब्धता बड़ी परीक्षण श्रृंखला को मजबूत परिणाम देने की अनुमति देती है; 4) ज्यादातर इस्तेमाल किए गए मॉडलों से कोशिकाओं को अलग करने, संस्कृति और आनुवंशिक रूप से संशोधित करने का ज्ञान कई प्रजातियों24, 25,26 में वीवो विश्लेषण में सक्षम बनाता है और इस प्रकार पहले इलाज किए गए रोगियों के लिए एक बेहतर जोखिम-लाभ अनुपात प्रदान करता है; 5) प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लचीलापन विभिन्न मॉडलों और प्रयोगात्मक सेट अप में और आनुवंशिक इंजीनियरिंग के साथ और बिना सभी नेत्र कोशिका आधारित उपचारों के लिए इसके उपयोग की अनुमति देता है। इसके विपरीत, सेल लाइनों या मानव ऊतक के रूप में वैकल्पिक तकनीकों केवल सीमित हस्तांतरणीयता और/या सीमित निपटान के हैं । एआरपीई-19 जैसी सेल लाइनें प्रारंभिक प्रयोगों के लिए आदर्श हैं; हालांकि, कम पिगमेंटेशन और उच्च प्रसार प्राथमिक कोशिकाओं से काफी अलग1. आरपीई और आईपीई कोशिकाएं, जो मानव दाता ऊतक से अलग हैं, विट्रो प्रयोगों में हस्तांतरणीय के लिए एक कीमती स्रोत प्रदान करती हैं; हालांकि, हम एक अमेरिकी-अमेरिकी नेत्र बैंक से मानव ऊतक प्राप्त करते हैं जिसका अर्थ है कि ऊतक कम से कम दो दिन पुराना है (परमाणु के बाद) और एक लंबे और महंगे परिवहन की आवश्यकता होती है, लेकिन स्थानीय दाता ऊतक एक उत्पादक अनुसंधान के लिए पर्याप्त मात्रा में उपलब्ध नहीं है। प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग के लाभ की पुष्टि अन्य समूहों के कई अध्ययनों से होती है27,28.
पीईडीएफ और/या जीएम-सीएसएफ के लिए जीन कोडिंग के साथ प्राथमिक आरपीई और आईपीई कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एसबी100एक्स ट्रांसपोसन प्रणाली का उपयोग करके सेल आधारित गैर-वायरल जीन थेरेपी के विकास के लिए क्रमशः29,30,31,32,हमने पहली बार ARPE-19 सेल1 1 के ट्रांसफेक्शन की स्थापना की . इसके बाद, अलगाव और ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल आसानी से सुलभ गोजातीय और पोर्सिन प्राथमिक कोशिकाओं में स्थापित किए गए थे। अब, पांच विभिन्न प्रजातियों से प्राथमिक आरपीई और आईपीई कोशिकाओं के अलगाव और ट्रांसफेक्शन की स्थापना की गई है, छोटे (माउस के रूप में) से बड़े स्तनधारियों (मवेशियों के रूप में) । इसकी पुष्टि प्राथमिक आरपीई और आईपीई कोशिकाओं में मानव दाता आंखों सेप्राप्त 30से की गई थी । एटएमपी के अच्छे विनिर्माण पद्धतियों (जीएमपी) के अनुरूप उत्पादन को मानव दाता ऊतक के साथ-साथ33का उपयोग करके मान्य किया गया था। अंत में, दृष्टिकोण की सुरक्षा और दक्षता दोनों का मूल्यांकन वीवो में तीन अलग-अलग प्रजातियों में किया गया था जिसके लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है: माउस, चूहा और खरगोश। नैदानिक सेट-अप में, रोगी से एक आईरिस बायोप्सी काटा जाएगा और आईपीई कोशिकाओं को अलग किया जाएगा और साफ कमरे में संक्रमित किया जाएगा, इससे पहले कि कोशिकाओं को एक ही मरीज में सबretinally वापस प्रत्यारोपित किया जाएगा । पूरी प्रक्रिया एक शल्य चिकित्सा सत्र के दौरान होगी जो लगभग 60 मिनट तक चलेगी। उपचार दृष्टिकोण के विकास और इसकी दक्षता के मूल्यांकन ने मजबूत और कुशल जीन वितरण विधियों को लागू करने, जीन वितरण, चिकित्सीय प्रोटीन उत्पादन और न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभावों की दक्षता का विश्लेषण करने और वीवो1,24, 25, 29,30 में दृष्टिकोण का परीक्षण करने के लिए सेल प्रत्यारोपण का उत्पादन करने के लिए उत्कृष्ट इन विट्रो और पूर्व वीवो मॉडल का अनुरोधकिया। . यह उल्लेखनीय है कि चिकित्सा जिनेवा के कैंटन के अनुसंधान के लिए नैतिक आयोग से एक नैदानिक चरण आईबी/IIa परीक्षण के लिए नैतिक अनुमोदन किया है लायक है (संख्या 2019-00250) और वर्तमान में पिछले पूर्व नैदानिक स्विस नियामक अधिकारियों द्वारा प्राधिकरण के लिए अनुरोध डेटा प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं । इस संबंध में, वीवो डेटा में प्री-क्लीनिकल ने सीएनवीऔर उत्कृष्ट सुरक्षा24, 25,31में उल्लेखनीय कमी का प्रदर्शन किया।
यहां, गोजातीय, सुअर, खरगोश, चूहा और माउस से आरपीई/आईपीई कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति, और एक कुशल जीन वितरण विधि के रूप में इलेक्ट्रोपॉशन के साथ संयुक्त एकीकृत SB100X ट्रांसपोसन प्रणाली के उपयोग का वर्णन किया गया है । विशेष रूप से, प्राथमिक पीई कोशिकाओं को पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ को अधिक एक्सप्रेस करने के लिए संक्रमित किया गया था। इन प्रोटोकॉलों का संग्रह इन विट्रो और वीवो अध्ययनों में एटएमपी विकास के सभी पूर्व-नैदानिक चरणों में प्रदर्शन करने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, सेट-अप में रुचि और बीमारियों के अन्य जीन के अनुकूल होने की क्षमता है ।
पीई कोशिकाओं को अलग और संस्कृति के लिए मानकीकृत तरीके होने रेटिना अपक्षयी रोगों के लिए नए चिकित्सा दृष्टिकोण विकसित करने में मौलिक है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ, पीई कोशिकाओं को विभिन्न प्रजाति…
The authors have nothing to disclose.
एक धन्यवाद ग्रेग Sealy और एलेन कोंटी उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए हकदार हैं । इस काम को यूरोपियन कमिशन ने सातवें फ्रेमवर्क प्रोग्राम, स्विस नेशनल साइंसेज फाउंडेशन और श्मीडर-बोह्रिश फाउंडेशन के संदर्भ में सपोर्ट किया था । Z.I. यूरोपीय अनुसंधान परिषद, ईआरसी एडवांस्ड [ईआरसी-2011-एडीजी 294742] और बी.M डब्ल्यू से फुलब्राइट रिसर्च ग्रांट और स्विस गवर्नमेंट एक्सीलेंस स्कॉलरशिप से फंडिंग प्राप्त की ।
12-well plates | Corning | 353043 | |
24-well plates | Corning | 353047 | |
48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
6-well plate | Greiner | 7657160 | |
Betadine | Mundipharma | ||
Bonn micro forceps flat | |||
Colibri forceps (sterile) | |||
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
Forceps (different size) (sterile) | |||
Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
pFAR4-PEDF | |||
pFAR4-SB100X | |||
pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
Vannas spring scissors curved (sterile) |