Isolasjon, kultur og genteknologi av pattedyr primærpigment epitelceller for ikke-viral genterapi

Summary

Her presenteres en protokoll for å isolere og transfektere primær iris og retinal pigment epitelceller fra ulike pattedyr (mus, rotte, kanin, gris og storfe). Metoden er ideelt egnet til å studere okulære genterapitilnærminger i ulike oppsett for ex vivo-analyser og in vivo-studier som kan overføres til mennesker.

Abstract

Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er den hyppigste årsaken til blindhet hos pasienter >60 år, og påvirker ~ 30 millioner mennesker over hele verden. AMD er en multifaktoriell sykdom påvirket av miljømessige og genetiske faktorer, noe som fører til funksjonsnedsettelse av netthinnen på grunn av retinal pigment epitel (RPE) celle degenerasjon etterfulgt av fotoreseptor nedbrytning. En ideell behandling vil omfatte transplantasjon av sunne RPE-celler som utskiller nevrobeskyttende faktorer for å forhindre RPE-celledød og fotoreseptordegenerering. På grunn av funksjonelle og genetiske likheter og muligheten for en mindre invasiv biopsi, ble transplantasjonen av irispigment epitelceller (IPE) foreslått som en erstatning for degenererte RPE. Sekresjon av nevrobeskyttende faktorer med et lavt antall subretinally-transplanterte celler kan oppnås ved Sleeping Beauty (SB100X) transposonmediert transfeksjon med genkoding for pigment epitel-avledet faktor (PEDF) og / eller granulocytt makrofag-koloni stimulerende faktor (GM-CSF). Vi etablerte isolasjon, kultur og SB100X-mediert transfeksjon av RPE- og IPE-celler fra ulike arter, inkludert gnagere, griser og storfe. Globuser er utplantet og hornhinnen og linsen fjernes for å få tilgang til iris og netthinnen. Ved hjelp av en skreddersydd spatel fjernes IPE-celler fra den isolerte irisen. For å høste RPE-celler kan det være nødvendig med en trypsininkubasjon, avhengig av arten. Deretter, ved hjelp av RPE-tilpasset spatel, blir celler suspendert i medium. Etter sådd overvåkes celler to ganger i uken, og etter å ha nådd samløp, transfektert av elektroporasjon. Genintegrasjon, uttrykk, proteinsekresjon og funksjon ble bekreftet av qPCR, WB, ELISA, immunfluorescens og funksjonelle analyser. Avhengig av arten kan 30.000-5 millioner (RPE) og 10.000-1,5 millioner (IPE) celler isoleres per øye. Genmodifiserte celler viser betydelig PEDF/GM-CSF-overtrykk med kapasitet til å redusere oksidativt stress og tilbyr et fleksibelt system for ex vivo-analyser og in vivo-studier som kan overføres til mennesker for å utvikle okulære genterapitilnærminger.

Introduction

Vår gruppe fokuserer på utvikling av regenerative tilnærminger for å behandle nevroretinal degenerasjon, det vil si AMD, av RPE- og IPE-basert ikke-viral genterapi. Den prekliniske etableringen av slike terapier nødvendiggjør in vitro-modeller som kan overføres til mennesker. Dermed er målet med studien som presenteres her å levere protokoller for isolasjon, kultur og genteknologi av primære RPE- og IPE-celler. Begrunnelsen for å etablere isolering av PE-celler fra flere arter er å robust bekrefte sikkerheten og effektiviteten av tilnærmingen og øke reproduserbarheten og overførbarheten. Den tilgjengelige menneskelige RPE-cellelinjen ARPE-19 er forskjellig fra primærceller (f.eks. de er mindre pigmenterte) og er derfor bare av begrenset verdi for prekliniske analyser¹. I tillegg kan ikke-menneskelige pattedyrceller kjøpes for mindre kostnader og i større mengder; humant donorvev kan fås fra ulike eye banks, men tilgjengeligheten er begrenset og dyr. Endelig må nye avanserte terapipreparater (ATMP, dvs. celle, vev eller genterapipreparat) brukes i minst to forskjellige arter før de testes hos pasienter, og disse in vivo-studiene ber om fremstilling av allogene celletransplantasjoner.

Retinal nevrodegenerative sykdommer er den ledende årsaken til blindhet i industrialiserte land, bestående av vanlige sykdommer som AMD, samt sjeldne sykdommer som retinitis pigmentosa, der retinal celledød til slutt fører til blindhet. RPE-celler, fotoreseptor og retinal ganglion celler (RGC) skade kan i noen tilfeller bli redusert, men det er for tiden ingen kurative terapier tilgjengelig. ATMPer tilbyr potensial til å korrigere genfeil, integrere terapeutiske gener eller erstatte degenererte celler, og dermed muliggjøre utvikling av regenerative og kurative terapier for sykdommer som AMD; 13 genterapier har allerede fått markedsføringsgodkjenning, inkludert en terapi for å behandle RPE65 mutasjonsrelatert retinal degenerasjon^2,3. Blant eldre voksne (>60 år) påvirkes ~ 30 millioner mennesker over hele verden av enten neovascular (nvAMD) eller avascular (aAMD) AMD⁴. Begge formene er indusert av aldersrelaterte utløsere, inkludert oksidativ skade, funksjonshemming og tap av RPE-celler etterfulgt av fotoreseptorforringelse, blant annet (f.eks. genetiske risikohaller, røyking, hypertensjon)^5,6. I nvAMD forverres patogenese av en ubalanse av angiogene og anti-angiogene faktorer til fordel for den angiogene vaskulære endoteliale vekstfaktoren (VEGF) som induserer koroidal neovascularization (CNV). Til dags dato kan bare nvAMD behandles ved månedlige intravitreale injeksjoner av inhibitorer av VEGF-proteinet for å undertrykke CNV; ingen effektiv behandling er ennå tilgjengelig for aAMD^6,7.

Flere studier evaluerte cellebaserte terapier for å erstatte anti-VEGF-terapien: studier laget av Binder et al., der nyhøstede autologe RPE-celler ble transplantert til pasienter med nAMD^8,9,10, viste moderat visuell forbedring, men bare en liten gruppe pasienter nådde en endelig synsskarphet høy nok til å muliggjøre lesing. Nylig brukte en klinisk fase I-studie en embryonal stamcelle-avledet RPE-patch for å behandle AMD med lovende resultater; det vil si effekt, stabilitet og sikkerhet av RPE-patchen i opptil 12 måneder hos 2 av de 10 pasientene som ble behandlet¹¹. I tillegg har flere grupper publisert studier der autologE RPE-Bruchs membran-choroid flekker ble høstet fra perifer netthinnen og transplantert til makula^12,13,14; og indusert pluripotent stamcelle (iPSC)-avledede RPE-flekker ble generert for^{transplantasjon 15}. For aAMD har antistoffer rettet mot komplementveien blitt testet i kliniske studier^6,16 og en fase I-studie ved hjelp av en enkelt intravitreal injeksjon av en adeno-assosiert viral (AAV) vektorkoding av genet for faktor CD59 (AAVCAGsCD59) hos pasienter med geografisk atrofi (GA) ble fullført¹⁷; fase II-studien startet nylig og tar sikte på å rekruttere 132 pasienter med avansert aAMD og å evaluere utfallet ved 2 år etter intervensjon¹⁸. Til slutt har FocuS-studiegruppen startet en klinisk fase I/II multisenterstudie som evaluerer sikkerhet, doserespons og effekt av en rekombinant ikke-replikerende AAV-vektor som koder en menneskelig komplementfaktor¹⁹.

Primært er målet med en regenerativ AMD-terapi transplantasjon av funksjonelle RPE-celler, som ble skadet eller mistet. Imidlertid deler IPE- og RPE-celler mange funksjonelle og genetiske likheter (f.eks. fagocytose og retinolmetabolisme), og fordi IPE-celler er mer gjennomhøstet, har de blitt foreslått som en RPE-erstatning²⁰. Selv om det tidligere har vist seg at IPE-celletransplantasjon forsinker fotoreseptordegenerering i dyremodeller^21,22 og stabiliserer visuell funksjon hos pasienter med sluttfase nvAMD, ble det ikke observert noen signifikant forbedring hos disse pasientene²³. Mangelen på effekt kan skyldes det lave antallet transplanterte celler, og/eller ubalansen av nevrobeskyttende netthinnefaktorer. En alternativ tilnærming ville være å transplantere transfekterte pigmentepiteleceller som overekspresserer nevrobeskyttende faktorer for å gjenopprette retinal homeostase, opprettholde gjenværende RPE-celler og beskytte fotoreseptorer og RGCer mot degenerasjon. Følgelig foreslår vi en ny terapi som består av transplantasjon av funksjonelle RPE- eller IPE-celler som har gjennomgått genteknologi for å utskille nevrobeskyttende og anti-angiogene proteiner, som PEDF, GM-CSF eller insulinlignende vekstfaktorer (IGFer). Fordelen med å utvikle og analysere denne tilnærmingen i flere arter i stedet for å bruke en cellelinje, bare en art eller menneskelig vev er: 1) økt reproduserbarhet og overførbarhet av resultatene som vist av mange studier realisert i uavhengige laboratorier og forskjellige arter^1,24,25; 2) gris eller storfe celler er feasibly disponibel uten offer av flere dyr; 3) tilgjengeligheten av spesielt gris og storfe celler tillater store testserier å produsere robuste resultater; 4) kunnskapen om å isolere, kultur og genetisk modifisere celler fra de mest brukte modellene muliggjør in vivo analyser i flere arter^24,25,26 og dermed tilbyr et forbedret risiko-nytte forhold for de første behandlede pasientene; 5) fleksibiliteten til protokollen som presenteres tillater bruk i ulike modeller og eksperimentelle oppsett og for alle okulære cellebaserte terapier med og uten genteknologi. I motsetning til dette er alternative teknikker som cellelinjer eller humant vev bare av begrenset overførbarhet og/eller begrenset disponerbarhet. Cellelinjer som ARPE-19 er ideelle for foreløpige eksperimenter. Lav pigmentering og høy spredning varierer imidlertid betydelig fra primærcellene¹. RPE- og IPE-celler, som er isolert fra humant donorvev, tilbyr en dyrebar kilde for overførbare in vitro-eksperimenter; Vi får imidlertid menneskelig vev fra en amerikansk-amerikansk øyebank, noe som betyr at vevet er minst to dager gammelt (etter enucleation) og krever en lang og dyr transport, men lokalt donorvev er ikke tilgjengelig i tilstrekkelige mengder for en produktiv forskning. Fordelen med bruk av primærceller bekreftes av flere studier fra andre gruppe^27,28.

For utvikling av en cellebasert ikke-viral genterapi ved hjelp av SB100X transposonsystem for transfektering av primære RPE- og IPE-celler med genkoding for PEDF og/eller GM-CSF for å behandle henholdsvis NVAMD og aAMD, henholdsvis^29,30,31,32, etablerte vi først transfeksjonen av ARPE-19 celler¹⁹ celler 1 . Deretter ble isolasjons- og transfeksjonsprotokollene etablert i lett tilgjengelige bovine og porcin primærceller. Nå er isolasjon og transfeksjon av primære RPE- og IPE-celler fra fem forskjellige arter etablert, fra små (som mus) til store pattedyr (som storfe). Det ble bekreftet i primære RPE- og IPE-celler avledet fra humane donorøyne³⁰. Good Manufacturing Practices (GMP)-kompatibel produksjon av ATMP ble validert ved hjelp av humant donorvev samt³³. Til slutt ble både sikkerhet og effektivitet av tilnærmingen vurdert in vivo i tre forskjellige arter som protokollen er tilpasset: mus, rotte og kanin. I det kliniske oppsettet vil en irisbiopsi bli høstet fra pasienten, og IPE-celler vil bli isolert og transfektert i det rene rommet, før cellene blir transplantert subretinalt tilbake til samme pasient. Hele prosessen vil finne sted under en enkelt kirurgisk økt som varer ca. 60 minutter. Utviklingen av behandlingstilnærmingen og evalueringen av effektiviteten ba om gode in vitro- og ex vivo-modeller for å implementere robuste og effektive genleveringsmetoder, for å analysere effektiviteten av genlevering, terapeutisk proteinproduksjon og nevrobeskyttende effekter, og å produsere celletransplantasjoner for å teste tilnærmingen i vivo^{1,24,25,29,30} . Det er verdt å nevne at terapien har den etiske godkjenningen for en klinisk fase Ib / IIa-studie fra den etiske kommisjonen for forskning av Kantonen Genève (nr. 2019-00250) og for tiden samles siste prekliniske data forespurt om autorisasjon av sveitsiske reguleringsmyndigheter ved hjelp av den presenterte protokollen. I denne forbindelse viste pre-kliniske in vivo-data en betydelig reduksjon i CNV og utmerket sikkerhet^24,25,31.

Her beskrives isolasjonen og kulturen til RPE/IPE-celler fra storfe, gris, kanin, rotte og mus, og bruken av det integrative SB100X transposonsystemet kombinert med elektroporasjon som en effektiv genleveringsmetode. Spesielt ble primære PE-celler transfektert til overekspress PEDF og GM-CSF. Innsamlingen av disse protokollene gjør det mulig å utføre in vitro- og in vivo-studier i alle prekliniske faser av ATMP-utvikling. Videre har oppsettet potensial til å tilpasses andre gener av interesse og sykdommer.

Protocol

Protokollene der dyr var involvert ble utført av sertifisert personell og etter autorisasjon av kantonal Département de la sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale of Geneva, Sveits, og ifølge ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research (godkjenning nr. GE/94/17). Voksne friske Brune Norge rotter, C57BL/6 mus, og New Zealand hvite kaniner ble euthanized av en overdose av Pentobarbital (150 mg/kg) fortynnet i 0,9% NaCl injisert intraperitoneal og …

Representative Results

PE-isolasjon fra ulike pattedyrarterVed hjelp av de nevnte protokollene ble IPE- og RPE-celler vellykket isolert og dyrket fra fem forskjellige arter. Antall celler oppnådd fra hver prosedyre avhenger av arten og størrelsen på øyet (Tabell 1). Som vist i figur 1, viser celler typisk PE-cellemorfologi og pigmentering (unntatt kaninceller vist, avledet fra albino New Zealand White (NZW) kaniner). Etter 21 dager etter isolasjon er cellene konfluensielle…

Discussion

Å ha standardiserte metoder for å isolere og kultur PE-celler er grunnleggende for å utvikle nye terapitilnærminger for retinal degenerative sykdommer. Med protokollene som presenteres her, kan PE-celler isoleres fra forskjellige arter og dyrkes i lange perioder (frem til nå ble den lengste kulturen opprettholdt i 2 år^1,38); typisk PE-cellemorfologi, pigmentering og funksjon ble observert (Figur 1, Figur 2<…

Materials

12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)