العزلة والتصوير الفاصل الزمني لخلايا ميسنشيم الجنينية للفأر الأولي لتحليل سمات الحركة الجماعية
Summary
نحن نقدم بروتوكولا لعزل وثقافة الخلايا الميكنشية الجنينية الأولية للفأرة للتصوير الفاصل الزمني للنمو ثنائي الأبعاد (ثنائي الأبعاد) ويقيس إصلاح الجروح. كما نقدم منهجية تحليل بيانات التصوير الفاصل الزمني لتحديد تكوين تيار الخلية والحركة الاتجاهية.
Abstract
تطوير الحنك هو عملية ديناميكية ، والتي تنطوي على النمو الرأسي للرفوف الفخمة الثنائية بجوار اللسان تليها الارتفاع والانصهار فوق اللسان. تؤدي العيوب في هذه العملية إلى الحنك المشقوق ، وهو عيب خلقي شائع. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن ارتفاع الجرف الفخم ينطوي على عملية إعادة عرض تحول اتجاه الرف من عمودي إلى أفقي. كان من الصعب دراسة دور الخلايا المتوسطة الجرف الحنكي في هذا إعادة عرض ديناميكية. وقد استخدم مؤخرا التحليل الكمي القائم على الفاصل الزمني للتصوير لإظهار أن خلايا الفأرة الجنينية الأولية يمكن أن تنظم نفسها بنفسها في حركة جماعية. يمكن للتحليلات الكمية تحديد الاختلافات في خلايا MEPM المتحولة من نموذج الماوس مع عيوب ارتفاع الحنك. تصف هذه الورقة أساليب عزل واستزراع خلايا MEPM من الأجنة E13.5 على وجه التحديد للتصوير بفارق زمني وتحديد السمات الخلوية المختلفة للحركة الجماعية ، بما في ذلك تدابير تكوين التيار ، ومحاذاة الشكل ، واستمرار الاتجاه. فإنه يفترض أن خلايا MEPM يمكن أن تكون بمثابة نموذج وكيل لدراسة دور mesenchyme الجرف الحنكي خلال عملية ديناميكية من الارتفاع. وستسمح هذه الأساليب الكمية للمحققين في مجال القحف الوجهي بتقييم ومقارنة سمات الحركة الجماعية في الخلايا المسيطرة والمتحولة، مما سيزيد من فهم إعادة عرض الميكنشيمال أثناء ارتفاع الجرف الحنكي. وعلاوة على ذلك، توفر خلايا MEPM نموذج خلايا حساسة نادرة للتحقيق في حركة الخلايا الجماعية بشكل عام.
Introduction
وقد درس تطوير الحنك على نطاق واسع كما عيوب في palatogenesis يؤدي إلى شق الحنك – عيب خلقي شائع يحدث في حالات معزولة أو كجزء من مئات المتلازمات1،2. تطور الحنك الجنيني هو عملية ديناميكية تنطوي على حركة وانصهار الأنسجة الجنينية. ويمكن تقسيم هذه العملية إلى أربع خطوات رئيسية: 1) التعريفي من الرفوف الفخمة, 2) النمو الرأسي للرفوف فخمة بجانب اللسان, 3) ارتفاع الرفوف الفخمة فوق اللسان, و 4) الانصهار من الرفوف الفخمة في خط الوسط1,3,4. على مدى العقود القليلة الماضية، تم تحديد العديد من المسوخ الماوس التي تظهر الحنك المشقوق5،6،7،8. وقد أشار توصيف هذه النماذج إلى وجود عيوب في خطوات التعريفي والانتشار والانصهار على الرف الفخم؛ ومع ذلك، كانت عيوب ارتفاع الجرف الحنكي نادرة. وبالتالي ، فإن فهم ديناميات ارتفاع الجرف الفخم هو مجال مثير للاهتمام من البحث.
تحليل دقيق لبعض المسوخ الماوس مع عيوب ارتفاع الجرف الحنكي أدى إلى النموذج الحالي تبين أن المنطقة الأمامية جدا من الرف الفخم يبدو أن الوجه، في حين أن حركة عمودية إلى أفقية أو “إعادة عرض” من الرفوف الفخمة يحدث في المناطق الوسطى إلى الخلفية من الحنك1،3،4، 9،10،11. ظهارة حافة وسيطة من الرف الفخم من المرجح أن يبدأ الإشارات المطلوبة لإعادة عرض هذا، الذي هو ثم مدفوعة mesenchyme الجرف الفخم. في الآونة الأخيرة, وقد حددت العديد من الباحثين تأخير ارتفاع الجرف الفخم في نماذج الماوس التي أظهرت الالتصاقات الشفوية العابرة التي تنطوي على رفوففخمة 12,13. ينطوي إعادة عرض mesenchymal على إعادة تنظيم الخلايا لخلق انتفاخ في الاتجاه الأفقي ، مع التراجع في نفس الوقت عن الرف الحنكي في الاتجاه الرأسي9و10و14. من بين العديد من الآليات المقترحة للتأثير على ارتفاع الجرف الحنكي وإعادة عرض mesenchymal الكامنة هي انتشار الخلايا15،16،17، التدرجات الكيميائية18، ومكونات مصفوفة خارج الخلية19،20. نشأ سؤال مهم: هل تأخر ارتفاع الرف الحنكي الملاحظ في الفئران الناقصة Specc1l –يرجع جزئيا أيضا إلى عيب في إعادة عرض الرف الحنكي ، ويمكن أن يظهر هذا العيب في إعادة العرض في عيب جوهري في سلوك خلايا MEPM الأولية21؟
وقد استخدمت الخلايا MEPM الأولية في مجال القحف الوجهي لكثير من الدراسات التي تنطوي على التعبير الجيني22،23،24،25،26،27،28،29، وعدد قليل منها التي تنطوي على انتشار30،31 والهجرة25،31،32 ، ولكن لا شيء لتحليل سلوك الخلية الجماعية. تم إجراء التصوير الفاصل الزمني لخلايا MEPM في الثقافة ثنائية الأبعاد و مقايسات إصلاح الجروح لإظهار أن خلايا MEPM أظهرت حركة اتجاهية وشكلت تيارات الخلايا المعتمدة على الكثافة – سمات الحركة الجماعية21. وعلاوة على ذلك، شكلت الخلايا المتحولة Specc1l تيارات خلايا أضيق وأظهرت مسارات هجرة الخلايا متغيرة للغاية. ويعتبر هذا النقص في حركية منسقة للمساهمة في تأخير ارتفاع الحنك في الأجنة متحولة Specc1l 13,21. وهكذا، فإن هذه المقايسات البسيطة نسبيا باستخدام خلايا MEPM الأولية قد تكون بمثابة وكيل لدراسة إعادة عرض mesenchymal أثناء ارتفاع الجرف الحنكي. تصف هذه الورقة عزلة وثقافة خلايا MEPM الأولية ، وكذلك التصوير والتحليل الفاصل الزمني ، للمقاايسات 2D وإصلاح الجروح.
Protocol
Representative Results
Discussion
ارتفاع الجرف بالاتال يشكل الرأسي إلى الأفقي إعادة عرض الحدث1،3،4،9،11. ومن المسلم به أن هذه العملية إعادة عرض يتطلب الخلايا المتوسطة الجرف الحنكي أن تتصرف بشكل تنسيقي. تظهر التحليلات مع خلايا MEPM البرية…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا المشروع جزئيا المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة DE026172 (I.S.)، وGM102801 (A.C). كما تم دعم I.S. جزئيا من منحة مركز التميز البحثي الطبي الحيوي (المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة P20 GM104936)، ومنحة امتياز أبحاث البحوث الطبية الحيوية من كانساس IDeA (المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة P20 GM103418)، ومنحة مركز كانساس لأبحاث الإعاقات الذهنية والتنموية (KIDDRC) (U54 يونيس كينيدي شرايفر المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
Riferimenti
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
- Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
- Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
- Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
- Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
- Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
- Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
- Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
- Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
- Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
- Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
- Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
- Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
- Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
- He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Biologia dello sviluppo. 457 (1), 57-68 (2020).
- Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
- Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
- Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
- Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
- Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
- Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
- Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
- Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
- Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, 2840-2848 (2014).
- Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
- Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
- Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
- Soderholm, J., Heald, R. Scratch n’ screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
- Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , (2021).
