Isolierung und Zeitraffer-Bildgebung von primären embryonalen palatalen Mesenchymzellen der Maus zur Analyse kollektiver Bewegungsattribute
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für die Isolierung und Kultur von primären embryonalen palatalen mesenchymalen Zellen der Maus für die Zeitraffer-Bildgebung von zweidimensionalen (2D) Wachstums- und Wundreparaturassays. Wir stellen auch die Methodik für die Analyse der Zeitraffer-Bildgebungsdaten zur Verfügung, um die Zellstrombildung und die Richtungsmotilität zu bestimmen.
Abstract
Die Entwicklung des Gaumens ist ein dynamischer Prozess, der ein vertikales Wachstum der bilateralen Gaumenregale neben der Zunge beinhaltet, gefolgt von einer Erhöhung und Fusion über der Zunge. Defekte in diesem Prozess führen zu Gaumenspalten, einem häufigen Geburtsfehler. Neuere Studien haben gezeigt, dass die Palatal-Regalerhöhung einen Umbauprozess beinhaltet, der die Ausrichtung des Regals von einer vertikalen in eine horizontale transformiert. Die Rolle der mesenchymalen Zellen des palatalen Regals bei diesem dynamischen Umbau war schwer zu untersuchen. Die auf Zeitraffer-Bildgebung basierende quantitative Analyse wurde kürzlich verwendet, um zu zeigen, dass sich primäre embryonale palatale mesenchymale (MEPM) Zellen der Maus selbst zu einer kollektiven Bewegung organisieren können. Quantitative Analysen konnten Unterschiede in mutierten MEPM-Zellen aus einem Mausmodell mit Gaumenerhöhungsdefekten identifizieren. Dieses Papier beschreibt Methoden zur Isolierung und Kultivierung von MEPM-Zellen aus E13,5-Embryonen – speziell für die Zeitraffer-Bildgebung – und zur Bestimmung verschiedener zellulärer Attribute kollektiver Bewegung, einschließlich Messungen für die Strömungsbildung, Formausrichtung und Persistenz der Richtung. Es postuliert, dass MEPM-Zellen als Proxy-Modell für die Untersuchung der Rolle des palatalen Schelfmesenchyms während des dynamischen Elevationsprozesses dienen können. Diese quantitativen Methoden werden es Forschern im kraniofazialen Bereich ermöglichen, kollektive Bewegungsattribute in Kontroll- und Mutantenzellen zu bewerten und zu vergleichen, was das Verständnis des mesenchymalen Umbaus während der Palatalschellferhöhung verbessern wird. Darüber hinaus liefern MEPM-Zellen ein seltenes mesenchymales Zellmodell zur Untersuchung der kollektiven Zellbewegung im Allgemeinen.
Introduction
Die Entwicklung des Gaumens wurde ausführlich untersucht, da Defekte in der Gaumenogenese zu Gaumenspalten führen – einem häufigen Geburtsfehler, der in Einzelfällen oder als Teil von Hunderten von Syndromen auftritt1,2. Die Entwicklung des embryonalen Gaumens ist ein dynamischer Prozess, der die Bewegung und Fusion von embryonalem Gewebe beinhaltet. Dieser Prozess kann in vier Hauptschritte unterteilt werden: 1) Induktion von Palatalregalen, 2) vertikales Wachstum der Palatalregale neben der Zunge, 3) Erhöhung der Palatalregale über der Zunge und 4) Fusion der Palatalregale in der Mittellinie1,3,4. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Mausmutanten identifiziert, die Gaumenspalte5,6,7,8manifestieren. Die Charakterisierung dieser Modelle hat auf Defekte in der Induktion, Proliferation und Fusion des palatalen Regals hingewiesen; Gaumensche Regalerhöhungsfehler waren jedoch selten. Daher ist das Verständnis der Dynamik der Palatal-Schelfhöhe ein faszinierendes Forschungsgebiet.
Die sorgfältige Analyse einiger Mausmutanten mit Gaumenregalhöhendefekten hat dazu geführt, dass das aktuelle Modell zeigt, dass der sehr vordere Bereich des Palatalregals nach oben zu kippen scheint, während eine vertikale bis horizontale Bewegung oder “Umgestaltung” der Gaumenregale in den mittleren bis hinteren Bereichen des Gaumens auftritt1,3,4, 9,10,11. Das mediale Randepithel des Palatalregals leitet wahrscheinlich die für diesen Umbau erforderliche Signalisierung ein, die dann vom mesenchym des palatalen Regals angetrieben wird. In jüngster Zeit haben viele Forscher eine Verzögerung der Palatal-Regalerhöhung in Mausmodellen identifiziert, die vorübergehende orale Adhäsionen mit Palatalregalen zeigten12,13. Der mesenchymale Umbau beinhaltet die Reorganisation der Zellen, um eine Ausbuchtung in horizontaler Richtung zu erzeugen, während gleichzeitig das Palatalregal in vertikaler Richtung zurückgezogen wird9,10,14. Zu den verschiedenen Mechanismen, die vorgeschlagen wurden, um die Palatal-Schelferhöhung und die zugrunde liegende mesenchymale Remodellierung zubeeinflussen,gehören die Zellproliferation15,16,17, chemotaktische Gradienten18und extrazelluläre Matrixkomponenten19,20. Es stellte sich eine wichtige Frage: Ist die bei Specc1l-defizientenMäusen beobachtete Verzögerung der palatalen Regalerhöhung auch teilweise auf einen Defekt im Palatal shelf remodeling zurückzuführen, und könnte sich dieser Remodeling-Defekt in einem intrinsischen Defekt im Verhalten primärer MEPM-Zellen manifestieren21?
Primäre MEPM-Zellen wurden im kraniofazialen Bereich für viele Studien mit Genexpression22,23,24,25,26,27,28,29und einigen wenigen mit Proliferation30,31 und Migration25,31,32 verwendet , aber keine für die kollektive Zellverhaltensanalyse. Die Zeitraffer-Bildgebung von MEPM-Zellen wurde in 2D-Kultur- und Wundreparaturassays durchgeführt, um zu zeigen, dass MEPM-Zellen gerichtete Bewegungen zeigten und dichteabhängige Zellströme-Attribute der kollektiven Bewegung bildeten21. Darüber hinaus bildeten Specc1l-mutante Zellen engere Zellströme und zeigten hochvariable Zellmigrationstrajektorien. Es wird angenommen, dass dieser Mangel an koordinierter Motilität zur Verzögerung der Gaumenerhöhung bei specc1l-mutierten Embryonenbeiträgt 13,21. Daher können diese relativ einfachen Assays unter Verwendung primärer MEPM-Zellen als Proxy für die Untersuchung des mesenchymalen Remodelings während der Erhöhung des palatalen Regals dienen. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung und Kultur von primären MEPM-Zellen sowie die Zeitraffer-Bildgebung und -Analyse für die 2D- und Wundreparaturassays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Palatal-Regalhöhe stellt ein vertikales bis horizontales Umbauereignis1,3,4,9,11 dar. Es wird postuliert, dass dieser Remodeling-Prozess erfordert, dass sich gaumale Regal-Mesenchymzellen koordiniert verhalten. Die Analysen mit Wildtyp-MEPM-Zellen zeigen, dass dieses Zellverhalten intrinsisch ist und quantitiert werden kann21. Somi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde zum Teil durch die National Institutes of Health Grants DE026172 (I.S.) und GM102801 (A.C.) unterstützt. I.S. wurde auch teilweise durch das Stipendium des Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), das Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence Grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) und das Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
Riferimenti
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
- Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
- Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
- Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
- Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
- Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
- Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
- Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
- Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
- Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
- Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
- Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
- Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
- Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
- He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Biologia dello sviluppo. 457 (1), 57-68 (2020).
- Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
- Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
- Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
- Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
- Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
- Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
- Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
- Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
- Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, 2840-2848 (2014).
- Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
- Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
- Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
- Soderholm, J., Heald, R. Scratch n’ screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
- Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , (2021).
