Isolasjon og tidsforløpavbildning av primære mus embryonale palatale mesenchymeceller for å analysere kollektive bevegelsesattributter
Summary
Vi presenterer en protokoll for isolasjon og kultur av primære mus embryonale palatal mesenchymale celler for tidsforløp avbildning av todimensjonal (2D) vekst og sårreparasjonsanalyser. Vi tilbyr også metodikk for analyse av tidsforløpavbildningsdata for å bestemme cellestrømsdannelse og retningsmotilitet.
Abstract
Utviklingen av ganen er en dynamisk prosess, som innebærer vertikal vekst av bilaterale palatale hyller ved siden av tungen etterfulgt av høyde og fusjon over tungen. Defekter i denne prosessen fører til kløft gane, en vanlig fødselsdefekt. Nyere studier har vist at palasshyllehøyde innebærer en ombyggingsprosess som forvandler retningen på hyllen fra vertikal til horisontal. Rollen til palatalhyllen mesenchymale celler i denne dynamiske ombyggingen har vært vanskelig å studere. Tidsforløp-avbildningsbasert kvantitativ analyse har nylig blitt brukt til å vise at primære mus embryonale palatal mesenchymale (MEPM) celler kan selv organisere seg i en kollektiv bevegelse. Kvantitative analyser kan identifisere forskjeller i mutante MEPM-celler fra en musemodell med ganehøydefeil. Dette dokumentet beskriver metoder for å isolere og dyrke MEPM-celler fra E13.5 embryoer – spesielt for tidsforløpavbildning – og for å bestemme ulike cellulære attributter for kollektiv bevegelse, inkludert tiltak for strømdannelse, formjustering og utholdenhet i retning. Det hevder at MEPM-celler kan tjene som en proxy-modell for å studere rollen som palatalhylle mesenchyme under den dynamiske høydeprosessen. Disse kvantitative metodene vil gjøre det mulig for etterforskere i kraniofacialfeltet å vurdere og sammenligne kollektive bevegelsesattributter i kontroll- og mutantceller, noe som vil øke forståelsen av mesenchymal ombygging under palatal hyllehøyde. Videre gir MEPM-celler en sjelden mesenchymal cellemodell for undersøkelse av kollektiv cellebevegelse generelt.
Introduction
Gane utvikling har blitt studert mye som defekter i palatogenesis fører til cleft gane-en vanlig fødselsdefekt som oppstår i isolerte tilfeller eller som en del av hundrevis av syndromer1,2. Utviklingen av den embryonale ganen er en dynamisk prosess som innebærer bevegelse og sammensmelting av embryonalt vev. Denne prosessen kan deles inn i fire hovedtrinn: 1) induksjon av palatale hyller, 2) vertikal vekst av palatalhyllene ved siden av tungen, 3) høyde av palatale hyller over tungen, og 4) fusjon av palatalhyllene på midtlinjen1,3,4. I løpet av de siste tiårene har mange musemutanter blitt identifisert som manifest cleft gane5,6,7,8. Karakterisering av disse modellene har indikert feil i palatalhylleinduksjon, spredning og fusjonstrinn; Høydefeil på palatalhyllen har imidlertid vært sjeldne. Dermed er det å forstå dynamikken i palatal hyllehøyde et spennende forskningsområde.
Nøye analyse av noen musemutanter med palasshøydefeil har ført til at den nåværende modellen viser at den svært fremre regionen av palatalhyllen ser ut til å vippe opp, mens en vertikal til horisontal bevegelse eller “ombygging” av palatale hyller forekommer i midten til bakre regioner i ganen1,3,4, 9,10,11. Medial kant epitelet på palatalhyllen initierer sannsynligvis signalene som kreves for denne ombyggingen, som deretter drives av palatalhyllen mesenchyme. Nylig har mange forskere identifisert palatal hyllehøydeforsinkelse i musemodeller som viste forbigående orale vedheft som involverer palatalhyller12,13. Den mesenchymale ombyggingen innebærer omorganisering av cellene for å skape en bule i horisontal retning, samtidig som palatalhyllen trekkes tilbake i vertikal retning9,10,14. Blant de flere mekanismene som foreslås å påvirke palatal hyllehøyde og underliggende mesenchymal ombygging er celleproliferasjon15,16,17, kjemoaktiske gradienter18og ekstracellulære matrisekomponenter19,20. Et viktig spørsmål oppstod: er den palatale hyllehøydeforsinkelsen observert i Specc1l-mangelfullemus også delvis på grunn av en defekt i palatalhyllens ombygging, og kan denne ombyggingsfeilen manifestere seg i en iboende defekt i oppførselen til primære MEPM-celler21?
Primære MEPM-celler har blitt brukt i kraniofacialfeltet for mange studier som involverer genuttrykk22,23,24,25,26,27,28,29og noen få som involverer spredning30,31 og migrasjon25,31,32 , men ingen for analyse av kollektiv cellevirkemåte. Tidsforløpavbildning av MEPM-celler ble utført i 2D-kultur- og sårreparasjonsanalyser for å vise at MEPM-celler viste retningsbevegelse og dannet tetthetsavhengige cellestrømmer-attributter for kollektiv bevegelse21. Videre dannet Specc1l mutantceller smalere cellestrømmer og viste svært variable cellemigrasjonsbaner. Denne mangelen på koordinert bevegelighet anses å bidra til ganens høydeforsinkelse i Specc1l mutant embryoer13,21. Dermed kan disse relativt enkle analysene ved hjelp av primære MEPM-celler fungere som en proxy for å studere mesenchymal ombygging under palatal hyllehøyde. Dette dokumentet beskriver isolasjonen og kulturen til primære MEPM-celler, samt tidsforløpavbildning og analyse, for 2D- og sårreparasjonsanalysene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Palatal hyllehøyde utgjør en vertikal til horisontal ombyggingshendelse1,3,4,9,11. Det er postulert at denne ombyggingsprosessen krever at palatalhyllemesenchymale celler oppfører seg koordinert. Analysene med WILDTYPE MEPM-celler viser at denne cellevirkemåten er innebygd og kan kvantiseres21. Dermed kan disse analysene brukes til …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble delvis støttet av National Institutes of Health grants DE026172 (I.S.), og GM102801 (A.C.). I.S. ble også delvis støttet av Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence grant (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) og Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) grant (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Developmenty HD090216).
Materials
| Beaker, 250 mL (x2) | Fisher Scientific | FB-100-250 | |
| CO2 | Matheson Gas | UN1013 | |
| Conical tubes, 15 mL (x1) | Midwest Scientific | C15B | |
| Debian operating system | computational analysis of time-lapse images | ||
| Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate | Cytiva Life Sciences | SH30243.01 | |
| EtOH, 100% | Decon Laboratories | 2701 | |
| EVOS FL Auto | ThermoFisher Scientific | AMAFD1000 | |
| EVOS Onstage Incubator | ThermoFisher Scientific | AMC1000 | |
| EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates | ThermoFisher Scientific | AMEPVH028 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) | Fine Science Tools | 11295-10 | Dissection |
| Instrument sterilizer bead bath | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microcetrifuge tubes, 1.5mL | Avant | 2925 | |
| Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight | Roboz | RS-5910 | Dissection |
| NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Silicone Insert, 2-well | Ibidi | 80209 | |
| Small Perforated Stainless Steel Spoon | Fine Science Tools | MC17C | Dissection |
| Spring Scissors, 4 mm | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Sterile 10 cm dishe(s) | Corning | 430293 | |
| Sterile 12-well plate(s) | PR1MA | 667512 | |
| Sterile 6-well plate(s) | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Sterile PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sterile plastic bulb transfer pipette | ThermoFisher Scientific | 202-1S | |
| Trypsin, 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
Riferimenti
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and molecular mechanisms of palatogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 115, 59-84 (2015).
- Li, C., Lan, Y., Jiang, R. Molecular and cellular mechanisms of palate development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1184-1191 (2017).
- Gritli-Linde, A. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37 (2008).
- Meng, L., Bian, Z., Torensma, R., Vonden Hoff, J. W. Biological mechanisms in palatogenesis and cleft palate. Journal of Dental Research. 88 (1), 22-33 (2009).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature Reviews Genetics. 12 (3), 167-178 (2011).
- Kousa, Y. A., Schutte, B. C. Toward an orofacial gene regulatory network. Developmental Dynamics. 245 (3), 220-232 (2016).
- Jin, J. Z., et al. Mesenchymal cell remodeling during mouse secondary palate reorientation. Developmental Dynamics. 239 (7), 2110-2117 (2010).
- Yu, K., Ornitz, D. M. Histomorphological study of palatal shelf elevation during murine secondary palate formation. Developmental Dynamics. 240 (7), 1737-1744 (2011).
- Chiquet, M., Blumer, S., Angelini, M., Mitsiadis, T. A., Katsaros, C. Mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation revealed by extracellular matrix and F-actin expression patterns. Frontiers in Physiology. 7, 392 (2016).
- Paul, B. J., et al. ARHGAP29 mutation is associated with abnormal oral epithelial adhesions. Journal of Dental Research. 96 (11), 1298-1305 (2017).
- Hall, E. G., et al. SPECC1L regulates palate development downstream of IRF6. Human Molecular Genetics. 29 (5), 845-858 (2020).
- Walker, B. E., Fraser, F. C. Closure of the secondary palate in three strains of mice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 4 (2), 176-189 (1956).
- Jin, J. Z., Li, Q., Higashi, Y., Darling, D. S., Ding, J. Analysis of Zfhx1a mutant mice reveals palatal shelf contact-independent medial edge epithelial differentiation during palate fusion. Cell Tissue Research. 333 (1), 29-38 (2008).
- Kouskoura, T., et al. The etiology of cleft palate formation in BMP7-deficient mice. PLoS One. 8 (3), 59463 (2013).
- Lan, Y., Zhang, N., Liu, H., Xu, J., Jiang, R. Golgb1 regulates protein glycosylation and is crucial for mammalian palate development. Development. 143 (13), 2344-2355 (2016).
- He, F., et al. Wnt5a regulates directional cell migration and cell proliferation via Ror2-mediated noncanonical pathway in mammalian palate development. Development. 135 (23), 3871-3879 (2008).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Yonemitsu, M. A., Lin, T. Y., Yu, K. Hyaluronic acid is required for palatal shelf movement and its interaction with the tongue during palatal shelf elevation. Biologia dello sviluppo. 457 (1), 57-68 (2020).
- Goering, J. P., et al. SPECC1L-deficient palate mesenchyme cells show speed and directionality defect. Scientific Reports. 11 (1), 1452 (2021).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways. Genes and Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).
- Vasudevan, H. N., Soriano, P. SRF regulates craniofacial development through selective recruitment of MRTF cofactors by PDGF signaling. Developmental Cell. 31 (3), 332-344 (2014).
- Vasudevan, H. N., Mazot, P., He, F., Soriano, P. Receptor tyrosine kinases modulate distinct transcriptional programs by differential usage of intracellular pathways. Elife. 4, 07186 (2015).
- Gao, L., et al. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and TGFbeta3-mediated mouse embryonic palatal mesenchymal cells. Dose Response. 17 (1), 1559325818786822 (2019).
- Iyyanar, P. P. R., Nazarali, A. J. Hoxa2 inhibits bone morphogenetic protein signaling during osteogenic differentiation of the palatal mesenchyme. Frontiers in Physiology. 8, 929 (2017).
- Jiang, Z., Pan, L., Chen, X., Chen, Z., Xu, D. Wnt6 influences the viability of mouse embryonic palatal mesenchymal cells via the beta-catenin pathway. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (6), 5339-5344 (2017).
- Liu, X., et al. Negative interplay of retinoic acid and TGF-beta signaling mediated by TG-interacting factor to modulate mouse embryonic palate mesenchymal-cell proliferation. Birth Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology. 101 (6), 403-409 (2014).
- Bush, J. O., Soriano, P. Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries. Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).
- Mo, J., Long, R., Fantauzzo, K. A. Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation. Frontiers in Physiology. 11, 588901 (2020).
- He, F., Soriano, P. A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development. PLoS Genetics. 9 (9), 1003851 (2013).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line. PLoS One. 12 (6), 0179078 (2017).
- Wu, K., Gauthier, D., Levine, M. D. Live cell image segmentation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 42 (1), 1-12 (1995).
- Neufeld, Z., et al. The role of Allee effect in modelling post resection recurrence of glioblastoma. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005818 (2017).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Annals of Biomedical Engineering. 33 (6), 854-865 (2005).
- Czirok, A., et al. Optical-flow based non-invasive analysis of cardiomyocyte contractility. Scientific Reports. 7 (1), 10404 (2017).
- Biggs, L. C., et al. Interferon regulatory factor 6 regulates keratinocyte migration. Journal of Cell Science. 127, 2840-2848 (2014).
- Czirok, A., Varga, K., Mehes, E., Szabo, A. Collective cell streams in epithelial monolayers depend on cell adhesion. New Journal of Physics. 15, 75006 (2013).
- Szabo, A., et al. Collective cell motion in endothelial monolayers. Physical Biology. 7 (4), 046007 (2010).
- Gulyas, M., Csiszer, M., Mehes, E., Czirok, A. Software tools for cell culture-related 3D printed structures. PLoS One. 13 (9), 0203203 (2018).
- Soderholm, J., Heald, R. Scratch n’ screen for inhibitors of cell migration. Chemistry & Biology. 12 (3), 263-265 (2005).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 59-65 (2012).
- Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
- Fantauzzo, K. A., Soriano, P. PDGFRbeta regulates craniofacial development through homodimers and functional heterodimers with PDGFRalpha. Genes & Development. 30 (21), 2443-2458 (2016).
- Rafi, S. K., et al. Anti-epileptic drug topiramate upregulates TGFβ1 and SOX9 expression in primary embryonic palatal mesenchyme cells: Implications for teratogenicity. PLoS ONE. , (2021).
