Новая статическая платформа используется для характеристики белковой структуры и взаимодействия сайтов в родной клеточной среде с использованием метода следа белка называется в клетке быстрого фотохимического окисления белков (IC-FPOP).
Быстрая фотохимическая окисление белков (FPOP) в сочетании с масс-спектрометрией (MS) стала бесценным инструментом в структурной протеомии для допроса белковых взаимодействий, структуры и конформациальной динамики белка как функции доступности растворителя. В последние годы сфера применения FPOP, метода гидроксилового радикального белка (HRPF), была расширена до маркировки белка в живых клеточных культурах, обеспечивая средства для изучения белковых взаимодействий в запутанной клеточной среде. Модификации внутриклеточного белка могут дать представление о лиганде, индуцированных структурных изменениях или конформациальных изменениях, сопровождающих образование белкового комплекса, все в клеточном контексте. Белковый след был достигнут с использованием обычной системы на основе потока и 248 нм лазера KrF excimer для получения гидроксиловых радикалов с помощью фотолиза перекиси водорода, требуя 20 минут анализа для одного образца клетки. Для облегчения экспериментов FPOP, решенных во времени, было впервые использовать новую платформу IC-FPOP на основе 6-колодец. В нынешней системе один лазерный импульс облучает всю колодец, что усеивает экспериментальные сроки FPOP, что приводит к 20 секундам времени анализа, что в 60 раз уменьшается. Это значительно сократило время анализа позволяет исследовать клеточные механизмы, такие как биохимические сигнальные каскады, сворачивание белков и дифференциальные эксперименты (т.е. без наркотиков против наркотиков) в зависимости от времени. Этот новый прибор, озаглавленный Платформа инкубатор с Movable XY этап (PIXY), позволяет пользователю выполнять клеточной культуры и IC-FPOP непосредственно на оптической скамейке с помощью платформы инкубатора с температурой, CO2 и контроля влажности. Платформа также включает в себя этап позиционирования, перистальтические насосы и зеркальную оптику для наведения лазерного луча. Условия IC-FPOP, такие как конфигурация оптики, скорость потока, переходные трансфекции и концентрация H2O2 в PIXY, были оптимизированы и рецензировано. Автоматизация всех компонентов системы позволит снизить манипуляции человека и увеличить пропускную способность.
Методы следа протеина могут показать глубокую информацию на организации протеинов. Эти основные структурные биологии MS-методы являются компонентом масс-спектрометрии инструментарий. Эти методы зонд белка высшей структуры порядка (HOS) и синергии черезковалентную маркировку 1,2,3,4. Быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP) использует гидроксиловые радикалы для окислительного изменения растворителя доступныхбоковых цепей аминокислот 5,6 (Таблица 1). Метод использует эксимерный лазер на 248 нм для фотолиза перекиси водорода (H2O2) для генерации гидроксиловых радикалов. Теоретически, 19 из 20 аминокислот могут быть окислительно изменены с Gly является единственным исключением. Однако из-за различных показателей реактивности аминокислот с гидроксильными радикалами, модификация только подмножества из них наблюдалась экспериментально. Тем не менее, метод имеет потенциал для анализа по длине последовательности белка5. FPOP изменяет белки на микросекундной шкале времени, что делает его полезным в изучении слабых взаимодействий с быстрыми темпами. Доступность растворителя изменяется при связывании лиганда или изменении конформации белка, таким образом, сила метода заключается в сравнении модели маркировки белка в нескольких состояниях (т.е. без лиганда по сравнению с лиганд-связанным). В результате, FPOP был успешным в выявлении белково-белкового и белково-лигандового взаимодействия сайтов и регионов конформацииизменения 7,8,9,10. Метод FPOP был расширен от изучения очищенных белковых систем до анализа в клетках. В-клеток FPOP (IC-FPOP) может окислительно модифицировать более тысячи белков в клетках, чтобы обеспечить структурную информацию черезпротеом 11,12. Обычная платформа IC-FPOP использует систему потока для потока ячеек одного файла мимо лазерного луча. Развитие этой системы позволило отдельным клеткам иметь равное воздействие лазерного облучения. Это привело к 13-кратному росту числа окислительно помеченных белков12. Однако ограничением системы потока является длина одного выборочного эксперимента, состоящего из 10-минутного интервала облучения, в течение которого происходит модификация, и дополнительного 10-минутного цикла стирки. Временные ограничения IC-FPOP делают его непригодным для изучения недолговечных белковых складных промежуточных или изменений, которые существуют между сетями взаимодействия в биохимических сигнальных каскадах. Это временное ограничение вдохновило на разработку новой платформы IC-FPOP, оснащенной более высокой пропускной способностью.
Для точного измерения структуры белка более высокого порядка в родной клеточной среде, новый дизайн позволяет клеточной культуры, которая будет осуществляться непосредственно на лазерной платформе, что позволяет IC-FPOP быть высокой пропускной способностью. Эта установка также позволяет свести к минимуму возмущения клеточной среды, в отличие от IC-FPOP, используя поток, где адепт клетки должны быть удалены из субстрата. Новая платформа позволяет IC-FPOP происходить в стерильной инкубационной системе с использованием CO2 и температурно-контролируемой верхней камеры при использовании настроенной зеркальной оптики для наведения лазерного луча, системы позиционирования для движения XY и перистралтических насосов для химического обмена. Новая платформа для проведения IC-FPOP озаглавлена «Инкубатор платформы» с Movable XY Stage (PIXY)(рисунок 1). В PIXY IC-FPOP осуществляется на клетках человека, выращенных в шести хорошо пластин в камере инкубатора платформы. Для этой конфигурации лазерный луч отражается вниз на пластину, используя зеркала, совместимые с лучом, как этап позиционирования, который держит инкубатор перемещается, в XY-самолете, так что лазерный луч стратегически выровнен только облучать один хорошо за один раз. Валидация исследования показывают, что IC-FPOP может быть выполнена быстрее в PIXY, чем в системе потока и приводит к увеличению аминокислотных модификаций на белок. Разработка этой новой платформы IC-FPOP будет изложена на знаниях, которые могут быть получены из клеточных экспериментов13.
Белки выполняют большую часть работы в живых клетках. Учитывая это значение, подробные данные о функции белка и более высокой структуре порядка (HOS) в клеточной среде необходимы для углубления понимания тонкостей в больших комплексах и энзиматических реакций в клетках, в отличие от очищенных систем. Для этого был принят метод гидроксиловой радикальной белковой печати ног (HRFP), озаглавленный «Быстрое фотохимическое окисление белков» (IC-FPOP). Большинство исследований FPOP были проведены в пробирке в относительно чистых белковых системах, что заметно контрастирует с переполненной молекулярной средой, которая влияет на связывающие взаимодействия и конформацию белка. В результате существует пропасть между выводами экспериментов in vitro 18 и результатами, полученными в реальной клеточной среде. Для преодоления разрыва между идеализированными условиями эксперимента in vitro FPOP и сложным характером ячейки была разработана новая автоматизированная платформа из шести хорошо, основанная на cell-FPOP. Эта новая технология FPOP способна идентифицировать и охарактеризовать эти молекулярные виды и отслеживать их динамические молекулярные взаимодействия как в здоровых, так и в больных состояниях. Эта новая платформа называется Платформа инкубатор с Movable XY этапе (PIXY).
FPOP успешно используется для характеристики структурной информации в протеоме. Однако каждый биологический метод имеет определенные ограничения, которые требуют дальнейшего совершенствования. Специфические реагенты необходимы во время лазерного фотолиза и для эффективного затухления неотредактированных гидроксиловырных радикалов. Разделение переваренных пептидов может потребовать большого количества времени, чтобы максимизировать структурную информацию. Это богатство информации может также потребовать обширной количественной оценки во время анализа данных после MS1. Платформа инкубатора, в том числе периферийного оборудования, необходимого для клеточной культуры и IC-FPOP на лазерной платформе, поставляется с большой стоимостью, которая не может быть осуществима для некоторых лабораторий. По мере дальнейшего прогресса надежные программные средства и инструменты анализа должны продвигать этот метод дальше; некоторые из которых представлены в данном исследовании. Текущие исследования в этой платформе инкубатора были проведены на HEK293T клеток и в C. elegans. Метод IC-FPOP был показан, чтобы быть совместимым с широким спектром клеточных линий, включая китайский хомяк яичников (CHO), Веро, MCF-7, и MCF10-Aклетки 19. Поскольку общий метод IC-FPOP можно перевести на эту статическую платформу, эти клеточные линии должны быть подменяемыми для изучения с использованием PIXY.
IC-FPOP использует H2O2 для окислительного изменения растворителя доступных боковых цепей аминокислот, чтобы затем дальнейшее различить белковых взаимодействий, структуры и метаболических эффектов в жизнеспособных клетках, что имеет важное значение в обеспечении биологического контекста. Перед экспериментом IC-FPOP необходимо подтвердить, что клетки жизнеспособны после добавления H2O2. Исследования жизнеспособности клеток показали, что клетки были жизнеспособными в присутствии концентраций H2O2 до 200 мМ 13. Важно также убедиться, что H2O2 вливается в окончательную концентрацию 200 мМ непосредственно на ячейках после удаления мультимедиа. Неспособность полностью удалить средства массовой информации культуры клеток вызовет различные концентрации H2O2. По сравнению со стандартными условиями, увеличение инкубационного времени до 10 секунд наряду сувеличением концентрацииH 2 O2 привело к увеличению количества белков, модифицированных IC-FPOP в инкубаторе платформы. Крайне важно премьер перистальтических насосов перед использованием для обеспечения насосы работают должным образом и жидкость рассеивается. Невыполнение этого решения может привести к пузырькам воздуха в трубках, недостаточному объему H2O2 для погружения клеток и/или недостаточному объему раствора для затухления.
Другой проблемой, которая может возникнуть, являются нежелательные задержки в системе. Примером этого является процесс проверки полученных команд для насосных систем, который добавляет значительные задержки порядка 1000 или более миллисекунд с использованием интеграционного программного обеспечения. Эта проблема может быть исправлена путем минимизации связи с насосами во время эксперимента и использования заранее установленных команд как можно больше.
В будущем целью PIXY является создание полностью автоматизированной и интегрированной системы. В дополнение к перистальным насосам, запуск лазерного импульса будет автоматизирован. Новая система позиционирования будет также использоваться для быстрого движения инкубатора платформы для повышения скорости и точности. Все компоненты системы будут по-прежнему запрограммированы с использованием интеграционного программного обеспечения для дальнейшего увеличения пропускной способности.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом NIH R01 GM128983-01.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |