Formålet med denne protokol er at bruge levende billeddannelse til at visualisere virkningerne af oxidative skader på lokaliseringen og dynamikken i subcellulære strukturer i Drosophila æggestokke.
Live imaging af Drosophila melanogaster æggestokke har været medvirkende til at forstå en række grundlæggende cellulære processer under udvikling, herunder ribonucleoprotein partikelbevægelse, mRNA lokalisering, organelle bevægelse, og cytoskeletal dynamik. Der er flere metoder til levende billedbehandling, der er blevet udviklet. På grund af det faktum, at hver metode indebærer dissekering enkelte ovarioler placeret i medier eller halocarbonolie, cellulære skader på grund af hypoxi og / eller fysisk manipulation vil uundgåeligt forekomme over tid. En downstream effekt af hypoxi er at øge oxidative skader i cellerne. Formålet med denne protokol er at bruge levende billeddannelse til at visualisere virkningerne af oxidative skader på lokaliseringen og dynamikken i subcellulære strukturer i Drosophila æggestokke efter induktion af kontrollerede cellulære skader. Her bruger vi brintoverilte til at fremkalde cellulære oxidative skader og give eksempler på virkningerne af sådanne skader på to subcellulære strukturer, mitokondrier og Clu lyksalighed partikler. Denne metode gælder dog for enhver undercellulær struktur. Begrænsningerne er, at brintoverilte kun kan føjes til vandige medier og ikke ville arbejde for billeddannelse, der bruger halocarbonolie. Fordelene er, at brintoverilte er let tilgængelig og billig, virker hurtigt, dets koncentrationer kan moduleres, og oxidativ skade er en god tilnærmelse af skader forårsaget af hypoxi samt generel vævsskade på grund af manipulation.
Flere forskellige cellulære stressfaktorer kan opstå under forsøgskulturen og manipulation af væv ex vivo, herunder varmechok, oxidativ stress, osmotisk stress, ernæringsmæssig stress og toksicitetsforhold. Live imaging er et kraftfuldt værktøj, der bruges til at visualisere real-time ændringer i ex vivo væv efter eksperimentel behandling og manipulation. Fine væv dissektioner og manipulation tage praksis, og mængden af tid fra dissektion til billeddannelse kan variere afhængigt af erfaring. Begrundelsen for at udvikle denne metode er baseret på bekymringen for, at forberedelse af væv til levende billeddannelse kan forårsage cellulær stress under dissektion og billeddannelse forberedelse. Dette kan især være problematisk for processer, der er følsomme over for ændringer i cellulær metabolisme og tilgængelige iltniveauer, såsom mitokondriefunktion. Mens der har en parallel vild type prøve er en vigtig kontrol, er der stadig mulighed for, at nogle eller alle observerede ændringer i subcellulære strukturer kan skyldes skader eller celle stress fra dissektion og ikke afspejler normal fysiologi eller behandling eller mutation, der undersøges.
For at løse dette potentielle problem bruger vi hydrogenperoxidtilsætning under live billeddannelse for at fremkalde cellulær oxidativ skade1. Formålet med denne metode er at fremkalde skade på væv for at overvåge effekten på subcellulære strukturer. Denne protokol er nyttig til to formål: 1) bestemmelse af, om ændringer i subcellulær lokalisering af interessestrukturen skyldes stress forårsaget af uerfaren dissektion og 2), når forskeren er sikker på de dissektionsteknikker, der er beskrevet for at overvåge virkningen af kontrolleret stress på interessestrukturen. Her viser vi to eksempler på, hvordan øget oxidativ skade forårsager ændringer i to subcellulære strukturer, mitokondrier og Clu lyksalighed partikler. For at gøre dette bruger vi Drosophila-æggestokken, som er en almindelig model for live billedundersøgelser. Det første eksempel undersøger mitokondrielokalisering. Det er vores erfaring, normal mitokondrie lokalisering i kvindelige kimceller er meget følsomme over for turbationer og kan fungere som en forløber for cellulære stress. Mitokondrier i Drosophila kvindelige kimceller er normalt jævnt fordelt over hele cytoplasma2. Hydrogenperoxidtilsætning får organellerne til hurtigt at fejllokalisere og klynge på samme måde som forskellige mutationer3,4,5. Det andet eksempel er lyksalighed partikler dannet af Clueless (Clu). Clu er et ribonukleoprotein, der er diffust i hele cytoplasmaet; det danner dog også mitokondrier-associerede partikler under optimale cellulære forhold5. Fordi tilstedeværelsen af Clu partikler er afhængig af sunde cellulære forhold, har vi kaldt dem “lyksalighed” partikler3,5,6. Tilsætning af brintoverilte får disse partikler til hurtigt at sprede sig og blive homogene i cytoplasmaet5. I løbet af vores undersøgelser har vi observeret ændringer i lokaliseringen af begge disse subcellulære strukturer, men først efter at have udført live billeddiagnostiske undersøgelser kunne vi fuldt ud forstå effekten af cellulær stress og oxidativ skade på lokalisering og dynamik af mitokondrier og lyksalighedspartikler.
Nytten af denne protokol som en tilføjelse til allerede etablerede eller alternative metoder afhænger af flere faktorer. For det første skal billedprotokollen være modtagelig for tilsætning af stoffer. Hvis prøven monteres under en coverlip og i halocarbonolie, vil denne metode ikke være mulig7. H2O2 tilsætning forårsager en hurtig stigning i oxidativ skade, derfor er denne tidshorisont muligvis ikke passende. Oxidativ skade kan betragtes som en proxy for hypoxi; Det kan dog være for hårdt eller for generaliseret til at fungere som en passende kontrol for skader på visse subcellulære komponenter. Endelig kan H 2 O2-tilføjelsen forbilleddiagnostiske eksperimenter, der varer timer som dem, der følger en udviklingsproces, være for stærk (f.eks.8). Test af en koncentrationskurve kan overvinde denne begrænsning.
Denne protokol kunne være en nyttig tilføjelse som en kontrol for artefakter på grund af æggestokkene dissektion og væv inkubation for enhver levende billeddannelse eksperiment. De kritiske trin svarer til dem, der findes for andre live billedbehandling protokoller. At lære at dissekere hele Drosophila æggestokke tager praksis; Denne færdighed kan dog normalt læres ret hurtigt med de relevante dissektionsværktøjer. Vanskeligere at mestre er at fjerne musklen omslutter æggestokkene og hver ovariole13. Dette skal gøres for at sikre muskelsammentrækninger ikke forstyrrer billederhvervelse. Hvis det ikke lykkes at bruge skærpede wolframnåle til at gøre dette, kan germariumet på spidsen af ovariolen gribes med pincet og ovariolen trukket fra muskelskeden. Denne teknik er imidlertid problematisk, hvis de tidligste udviklingsstadier skal undersøges, fordi de kan blive beskadiget. Et andet vigtigt skridt er ikke at løsne ovariolerne, der hviler på bunden af skålen, når der tilsættes H2O2. Et yderligere vigtigt aspekt deles af alle levende billeddannelse: forskeren bør sikre, at strukturen af interesse er fluorescerende godt mærket før behandling. De retter, der anvendes her (Tabel over materialer )er almindeligt anvendt til levende billeddannelse; Enhver skål eller rutsjebane med en glasslædslip i bunden eller endda en stor glasovertræksdåse skal dog fungere, så længe mediedråben kan dækkes for at forhindre mediefordampning. Mens vi bruger et bestemt mikroskop, skal ethvert omvendt mikroskop med et mål om tilstrækkelig forstørrelse til at se den pågældende subcellulære struktur og et tilsluttet kamera, der har tilstrækkelig opløsning og billedoptagelseshastighed, fungere.
Mens vores laboratorium primært er interesseret i mitokondriefunktion, kan denne metode være nyttig til at undersøge dynamikken og lokaliseringen af enhver subcellulær struktur eller organelle, såsom kernen, cytoskeleton eller endoplasmisk reticulum. Denne metode har dog begrænsninger. For at tilføje brintoverilte skal vævet være i et vandigt medie. En alternativ metode til levende billeddannelse er at bruge halocarbonolie, som har været medvirkende til at beskrive mange vigtige processer i Drosophila ovarioler, herunder det første eksempel på dynamisk bevægelse af GFP i en modelorganisme7,14. Hertil kommer, at tilføje brintoverilte til medierne forårsager udbredt oxidative skader, som kan være for generel en fornærmelse mod vævet til at være informativ for den cellulære proces af interesse, især for længere forsøg undersøge udviklingen. Selv om det måske ikke er muligt at udføre eksperimenter, der kræver visualisering af cellen over lange perioder på grund af denne hurtige, omfattende og sandsynligvis irreversible oxidative skader, har vi set, at den akutte brintoveriltebehandling, vi har beskrevet, gælder for de fleste stadier af oogenesis, da vi er i stand til at se de samme virkninger i de fleste stadier inden for billeddannelsesperioden. I betragtning af den lave pris og lethed af protokollen, kan det være en nyttig kontrol for skader og kan bruges som en behandling, før fiksering og antistof mærkning så godt.
I vores hænder efterligner H2O2-behandlingen ændringerne i mitokondriefejllokalisering og Clu lyksalighed partikelspredning, som vi ser i forskellige Drosophila-mutanter. Det efterligner også resultater, vi ser for nye forskere i laboratoriet læring dissektion teknikker. Derfor viste denne metode klart, at prøveforberedelse og generel cellulær stress kan føre til uventede og tidligere uforklarlige ændringer i mitokondriefejllokalisering og tilstedeværelsen af lyksalighedspartikler. Ved at flytte denne teknik fremad kan hydrogenperoxidkoncentrationerne moduleres ved hjælp af en højere eller lavere koncentration. Hvis en cellulær effekt ses ved hjælp af en lavere koncentration, er det muligt, at stressphoenotypen kan vendes ved at erstatte mediet med Complete Schneiders. Forskellige cellestressorer såsom carbonylcyanid m-chlorophenylhydrazone (CCCP), arsenit eller simpelt varmechok kan vise sig nyttige for generel cellulær stress for andre subcellulære strukturer. Da levende billeddannelse af ex vivo-væv kræver manuel manipulation og inkubation i forskellige medier, bør denne kontrol være en nyttig tilføjelse for at sikre, at eventuelle observationer er så tæt på normal fysiologi som muligt.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Jeremy Smyth for billedbehandling støtte og Ann C. Shenk for illustrationer, produktion og videography. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (1R01GM127938 til R.T.C.).
Active dry yeast | Red Star® | ||
CO2 gas | 99.9% purity | ||
CO2 pad | |||
Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |