Målet med denne protokollen er å bruke levende bildebehandling for å visualisere effekten av oksidativ skade på lokalisering og dynamikk av subcellulære strukturer i Drosophila eggstokkene.
Levende avbildning av Drosophila melanogaster eggstokkene har vært medvirkende til å forstå en rekke grunnleggende cellulære prosesser under utvikling, inkludert ribonucleoprotein partikkelbevegelse, mRNA lokalisering, organellebevegelse og cytoskeletal dynamikk. Det finnes flere metoder for levende bildebehandling som er utviklet. På grunn av det faktum at hver metode innebærer dissekering individuelle ovarioles plassert i media eller halokarbonolje, cellulær skade på grunn av hypoksi og / eller fysisk manipulasjon vil uunngåelig oppstå over tid. En nedstrøms effekt av hypoksi er å øke oksidativ skade i cellene. Formålet med denne protokollen er å bruke levende bildebehandling for å visualisere effekten av oksidativ skade på lokalisering og dynamikk av subcellulære strukturer i Drosophila eggstokkene etter induksjon av kontrollert cellulær skade. Her bruker vi hydrogenperoksid for å indusere cellulær oksidativ skade og gi eksempler på effekten av slik skade på to subcellulære strukturer, mitokondrier og Clu bliss partikler. Denne metoden gjelder imidlertid for en hvilken som helst subcellulær struktur. Begrensningene er at hydrogenperoksid bare kan legges til vandige medier og ikke vil fungere for bildebehandling som bruker halokarbonolje. Fordelene er at hydrogenperoksid er lett tilgjengelig og billig, virker raskt, konsentrasjonene kan moduleres, og oksidativ skade er en god tilnærming av skade forårsaket av hypoksi samt generell vevsskade på grunn av manipulasjon.
Flere forskjellige cellulære stressfaktorer kan oppstå under eksperimentell kultur og manipulering av vev ex vivo, inkludert varmesjokk, oksidativt stress, osmotisk stress, ernæringsmessige stress og toksisitetsforhold. Live imaging er et kraftig verktøy som brukes til å visualisere sanntidsendringer i ex vivo vev etter eksperimentell behandling og manipulasjon. Fine vevsdeksjoner og manipulasjon tar praksis, og tiden fra disseksjon til bildebehandling kan variere avhengig av erfaring. Begrunnelsen for å utvikle denne metoden er basert på bekymringen om at å forberede vev for levende avbildning kan forårsake cellulær stress under disseksjon og bildebehandlingspreparat. Dette kan være spesielt problematisk for prosesser som er følsomme for endringer i cellulær metabolisme og tilgjengelig oksygennivå, for eksempel mitokondriefunksjon. Mens å ha en parallell vill type prøve er en viktig kontroll, det er fortsatt mulighet for at noen eller alle observerte endringer i subcellulære strukturer kan skyldes skade eller celle stress fra disseksjon og reflekterer ikke normal fysiologi eller behandling eller mutasjon blir studert.
For å løse dette potensielle problemet bruker vi hydrogenperoksidtillegg under levende bildebehandling for å indusere cellulær oksidativ skade1. Formålet med denne metoden er å indusere skade på vev for å overvåke effekten på subcellulære strukturer. Denne protokollen er nyttig for to formål: 1) avgjøre om endringer i subcellulær lokalisering av strukturen av interesse skyldes stress forårsaket av uerfaren disseksjon og 2) når forskeren er trygg med disseksjon teknikker beskrevet for å overvåke effekten av kontrollert stress på strukturen av interesse. Her viser vi to eksempler på hvordan økt oksidativ skade forårsaker endringer i to subcellulære strukturer, mitokondrier og Clu bliss partikler. For å gjøre dette bruker vi Drosophila eggstokken som er en vanlig modell for levende bildebehandlingsstudier. Det første eksemplet undersøker mitokondrie lokalisering. Etter vår erfaring er normal mitokondrie lokalisering i kvinnelige bakterieceller svært følsomme for perturbasjoner og kan fungere som en harbinger av cellulær stress. Mitokondrier i Drosophila kvinnelige bakterieceller er normalt jevnt spredt over hele cytoplasma2. Hydrogenperoksid tillegg fører organeller å raskt feillokalisere og klynge på samme måte som ulike mutasjoner3,4,5. Det andre eksemplet er lykkepartikler dannet av Clueless (Clu). Clu er et ribonucleoprotein som er diffust gjennom cytoplasma; Det danner imidlertid også mitokondrier-tilknyttede partikler under optimale cellulære forhold5. Fordi tilstedeværelsen av Clu partikler er avhengig av sunne cellulære forhold, har vi kalt dem “bliss”partikler 3,5,6. Tilsetning av hydrogenperoksid fører til at disse partiklene raskt sprer seg og blir homogene i cytoplasma5. I løpet av våre studier har vi observert endringer i lokalisering av begge disse subcellulære strukturene, men først etter å ha utført levende bildestudier, kan vi fullt ut sette pris på effekten av cellulær stress og oksidativ skade på lokalisering og dynamikk av mitokondrier og lykkepartikler.
Nytten av denne protokollen som et tillegg til allerede etablerte eller alternative metoder avhenger av flere faktorer. For det første må bildeprotokollen være mottagelig for legemiddeltillegg. Hvis prøven er montert under en dekkslipp og i halokarbonolje, vil denne metoden ikke være mulig7. H2O2 tillegg forårsaker en rask økning i oksidativ skade, derfor kan denne tidsskalaen ikke være hensiktsmessig. Oksidativ skade kan betraktes som en proxy for hypoksi; Det kan imidlertid være for hardt eller for generalisert til å fungere som en passende kontroll for skade for visse subcellulære komponenter. Til slutt, for bildeeksperimenter som varer timer, for eksempel de som følger en utviklingsprosess, kan H2O2-tillegget være for sterkt (for eksempel8). Testing av en konsentrasjonskurve kan overvinne denne begrensningen.
Denne protokollen kan være et nyttig tillegg som en kontroll for artefakter på grunn av eggstokkavhandling og vev inkubasjon for alle levende bildebehandling eksperiment. De kritiske trinnene ligner på de som finnes for andre live imaging protokoller. Lære å dissekere hele Drosophila eggstokkene tar praksis; Denne ferdigheten kan imidlertid vanligvis læres ganske raskt med de riktige disseksjonsverktøyene. Vanskeligere å mestre er å fjerne muskelen omslutte eggstokkene og hver ovariol13. Dette må gjøres for å sikre at muskelsammentrekninger ikke forstyrrer bildeoppkjøp. Hvis bruk av skjerpet wolfram nåler for å gjøre dette ikke viser seg vellykket, germarium på spissen av ovariol kan gripes med tang og ovariol trukket fra muskelhylsen. Denne teknikken er imidlertid problematisk hvis de tidligste utviklingsstadiene skal undersøkes fordi de kan bli skadet. Et annet viktig trinn er å ikke løsne ovariolene hviler på bunnen av parabolen når du legger H2O2. Et ekstra viktig aspekt deles av all levende bildebehandling: forskeren bør sørge for at strukturen av interesse er fluorescerende godt merket før behandling. Rettene som brukes her (Table of Materials) brukes ofte til levende bildebehandling; Men enhver tallerken eller skli med en glassdeksler på bunnen eller til og med en stor glassdekslerslips skal fungere så lenge mediedråpen kan dekkes for å forhindre mediefordampning. Mens vi bruker et bestemt mikroskop, bør ethvert omvendt mikroskop med et mål om tilstrekkelig forstørrelse for å se den subcellulære strukturen det gjelder og et vedlagt kamera som har tilstrekkelig oppløsning og bildeopptakshastighet, fungere.
Mens vårt laboratorium primært er interessert i mitokondriefunksjon, kan denne metoden være nyttig å undersøke dynamikken og lokaliseringen av enhver subcellulær struktur eller organelle, for eksempel kjernen, cytoskeleton eller endoplasmatisk reticulum. Denne metoden har imidlertid begrensninger. For å legge til hydrogenperoksid må vevet være i vandige medier. En alternativ metode for levende bildebehandling er å bruke halokarbonolje, som har vært medvirkende til å beskrive mange viktige prosesser i Drosophila ovarioles, inkludert det første eksemplet på dynamisk bevegelse av GFP i en modellorganisme7,14. I tillegg forårsaker tilsetning av hydrogenperoksid til media bredspredning oksidativ skade som kan være for generell en fornærmelse mot vevet for å være informativ for den cellulære prosessen av interesse, spesielt for lengre eksperimenter som undersøker utvikling. Selv om det kanskje ikke er mulig å utføre eksperimenter som krever visualisering av cellen over lange perioder på grunn av denne raske, omfattende og sannsynligvis irreversible oksidativ skade, har vi sett at den akutte hydrogenperoksidbehandlingen vi har beskrevet, gjelder for de fleste stadier av oogenese, da vi er i stand til å se de samme effektene i de fleste stadier innen bildeperioden. Gitt den lave prisen og enkel av protokollen, det kan være en nyttig kontroll for skade og kan brukes som en behandling før fiksering og antistoff merking også.
I våre hender etterligner H2O2-behandling endringene i mitokondriedislokalisering og Clu bliss partikkeldispersjon som vi ser i ulike Drosophila mutanter. Det etterligner også resultater vi ser for nye forskere i laboratoriet læring disseksjon teknikker. Derfor viste denne metoden tydelig at prøveforberedelse og generell cellulær stress kan føre til uventede og tidligere uforklarlige endringer i mitokondriedislokalisering og tilstedeværelsen av lykkepartikler. Flytte denne teknikken fremover, hydrogenperoksid konsentrasjoner kan moduleres ved hjelp av en høyere eller lavere konsentrasjon. Hvis en cellulær effekt ses ved hjelp av en lavere konsentrasjon, er det mulig at stressfenotypen kan være reversibel ved å erstatte mediet med Complete Schneiders. Ulike cellestressorer som karbonylcyanid m-klorofenylhydrazon (CCCP), arsenitt eller enkelt varmesjokk kan være nyttig for generell cellulært stress for andre subcellulære strukturer. Siden levende avbildning av ex vivo vev krever manuell manipulering og inkubasjon i forskjellige medier, bør denne kontrollen være et nyttig tillegg for å sikre at eventuelle observasjoner er så nær normal fysiologi som mulig.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Dr. Jeremy Smyth for bildestøtte og Ann C. Shenk for illustrasjoner, produksjon og videografi. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (1R01GM127938 til R.T.C.).
Active dry yeast | Red Star® | ||
CO2 gas | 99.9% purity | ||
CO2 pad | |||
Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |