Abbiamo sviluppato un protocollo generalizzato per dissociare una grande quantità di singole cellule di alta qualità dall'epitelio e dal mesenchima / tessuto connettivo delle lingue del topo embrionali e adulte.
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Articolo metodologico
Dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima/tessuto connettivo dei topi embrionali di 12,5 e 8 settimane
In questo articolo
Sommario
Abstract
La dissociazione cellulare è stata una procedura essenziale per gli studi a livello di singola cellula e/o a livello di popolazione cellulare (ad esempio, sequenziamento dell'RNA a singola cellula e coltura cellulare primaria). Produrre cellule vitali e sane in grandi quantità è fondamentale e le condizioni ottimali per farlo sono dipendenti dai tessuti. Le popolazioni cellulari nell'epitelio della lingua e nel mesenchima sottostante /tessuto connettivo sono eterogenee e le strutture tissutali variano in diverse regioni e in diversi stadi di sviluppo. Abbiamo testato protocolli per isolare le cellule dall'epitelio della lingua del topo e dal mesenchima / tessuto connettivo nelle prime fasi di sviluppo [giornata embrionale 12.5 (E12.5)] e giovani adulti (8 settimane). Una separazione netta tra l'epitelio e il mesenchima/tessuto connettivo sottostante era facile da realizzare. Tuttavia, per elaborare e isolare ulteriormente le cellule, producendo cellule sane vitali in grandi quantità e un'attenta selezione del buffer di digestione enzimatica, del tempo di incubazione e della velocità e del tempo di centrifugazione sono fondamentali. L'incubazione di epitelio separato o mesenchima/tessuto connettivo sottostante nello 0,25% di tripsiderina-EDTA per 30 min a 37 °C, seguita da centrifugazione a 200 x g per 8 min ha portato a un alto rendimento delle cellule ad un alto tasso di vitalità (>90%) indipendentemente dalle fasi del mouse e dalle regioni della lingua. Inoltre, abbiamo scoperto che sia le cellule del tessuto epiteliale dissociato che mesenchimale /connettivo dalle lingue embrionali e adulte potrebbero sopravvivere nel mezzo a base di coltura cellulare per almeno 3 ore senza una significativa diminuzione della vitalità cellulare. I protocolli saranno utili per studi che richiedono la preparazione di cellule isolate dalle lingue del topo nelle prime fasi di sviluppo (E12.5) e giovani adulti (8 settimane) che richiedono la dissociazione cellulare da diversi compartimenti tissutali.
Introduzione
La lingua dei mammiferi è un organo complesso critico per il gusto, il parlare e la lavorazione degli alimenti. È composto da più tipi di tessuti altamente organizzati compartimentati da mesenchima / tessuto connettivo e coperti da un foglio epiteliale stratificato contenente papille gustative e papille gustative. Le popolazioni cellulari sia nell'epitelio della lingua che nel mesenchima/tessuto connettivo sono eterogenee. Per comprendere meglio le funzioni e la distribuzione di un particolare tipo di cellule nella lingua, sono necessari studi utilizzando cellule dissociate. Ad esempio, il sequenziamento dell'RNA a singola cella è un metodo potente e ad alta produttiv....
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Protocollo
L'uso degli animali (topi C57BL/6 durante tutto lo studio) è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Georgia ed è stato in conformità con le Linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali per la ricerca.
1. Uso animale
NOTA: I topi sono stati allevati e mantenuti nella struttura animale del dipartimento di scienze animali e lattiero-casearie dell'Università della Georgia a 22 °C sotto i cicli giorno/notte di 12 ore.
- Designare mezzogiorno del giorno di rilevamento della spina vaginale nei topi come giorno embriona....
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Risultati
Separazione dell'epitelio della lingua dal mesenchima/tessuto connettivo sottostante
Nella lingua embrionale del topo, uno spazio nello spazio sub-epiteliale è visibile dopo una corretta digestione enzimatica. I fogli epiteliali di alcune lingue sono separati senza forza meccanica durante l'incubazione.
Nella lingua adulta del topo, un'iniezione enzimatica di successo è indicata dal gonfiore nelle aree iniettate (Figura 1B2
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Discussione
Ad oggi, non è stato disponibile un protocollo dettagliato per la dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima /tessuto connettivo sottostante. Questo protocollo di dissociazione cellulare corrente fornisce una procedura riproducibile per generare una sospensione a singola cella con un'elevata vitalità cellulare (>90%) dai tessuti della lingua del topo, compresi i fogli epiteliali e i tessuti mesenchima/connettivi sia allo stadio embrionale che postnatale, anche se le cellule isolate di E12,5 e top.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato dai National Institutes of Health, dal numero di sovvenzione R01DC012308 e dall'R21DC018089 all'HXL. Grazie a Brett Marshall (Università della Georgia, Atene, GA) ed Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) per l'assistenza tecnica e la consultazione sulla dissociazione cellulare; a Francisca Gibson Burnley (Università della Georgia, Atene, GA) per l'editing in inglese.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| albumina sierica bovina (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenasi (Collagenasi A) | Sigma-Aldrich 10103586001 | ||
| (35 mm di diametro) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| (100 mm di diametro) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| (Student Fine Scissors) | Trova Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| siero fetale bovino (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| pinze fini (Dumount #3 Pincipe) | Trova strumento scientifico | 11293-00 | |
| emocitometro | Hausser Scientific | 3520 | |
| microscopio invertito con sistema di imaging (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| puntali per pipette a bassa ritenzione | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-forbici (Evo Spring Scissors) | Strumento per le scienze fini | 15800-01 | |
| ordito in plastica | VWR | 46610-056 | |
| spatola (cucchiaio Moria) | Strumento Fine Science | 10321-08 | |
| pinza chirurgica (pinza per laminectomia Dumount #2) | Strumento Fine Science | 11223-20 | |
| Trypan blu | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode' s soluzione | Sigma-Aldrich | T2145-10L | a base di sali di Tyrode |
| 0,25% tipico-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0,1 M Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Hoefer | 33946 | a base di 1 M PBS |
| 0,22-μ m filtro per siringa | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% etanolo | Koptec | 233919 | realizzato al 100% in etanolo |
| Siringa da 1 ml | BD | 8194938 | |
| Provetta per microcentrifuga a basso legame da 5 ml | Eppendorf | 30122348 | |
| ago da 30 G | BD | 9193532 | |
| 35-μ filtro cellulare m | Falcon | 64750 | |
| 70-μ filtro per cellule m | Falcon | 64752 |
Riferimenti
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple....
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Ristampe e permessi
