Ros imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal

Summary

Este protocolo describe el uso de un peróxido de hidrógeno genéticamente codificado (H₂O_2)-biosensoren neuronas de pez cebra cultivadas y larvas para evaluar las funciones fisiológicas de señalización de H 2 O₂durante el desarrollo del sistema nervioso. Se puede aplicar a diferentes tipos de células y modificar con tratamientos experimentales para estudiar especies reactivas de oxígeno (ROS) en el desarrollo general.

Abstract

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son moléculas de señalización bien establecidas, que son importantes en el desarrollo normal, la homeostasis y la fisiología. Entre los diferentes ROS, el peróxido de hidrógeno_(H2O₂₎se caracteriza mejor con respecto a los roles en la señalización celular. _H2O2 se ha implicado durante el desarrollo en varias especies. Por ejemplo, se ha detectado un aumento transitorio de_H2O₂ en embriones de pez cebra durante los primeros días después de la fertilización. Además, el agotamiento de una importante fuente celular de H₂O_2, la NADPH oxidasa (NOX), deteriora el desarrollo del sistema nervioso, como la diferenciación, el crecimiento axonal y la orientación de las células ganglionares de la retina (RGCs) tanto in vivo como in vitro. Aquí, se describe un método para la obtención de imágenes intracelulares H₂O₂ niveles en las neuronas de pez cebra cultivadas y larvas enteras durante el desarrollo utilizando el genéticamente codificado H₂O₂-biosensor específico, roGFP2-Orp1. Esta sonda puede expresarse de forma transitoria o estable en larvas de pez cebra. Además, la lectura ratiométrica disminuye la probabilidad de detectar artefactos debido a la expresión génica diferencial o efectos de volumen. En primer lugar, se demuestra cómo aislar y cultivar RGCs derivados de embriones de pez cebra que expresan transitoriamente roGFP2-Orp1. Luego, utilizamos larvas enteras para monitorear los niveles de_H2O₂ a nivel de tejido. El sensor ha sido validado por la adición de_H2O_2. Además, esta metodología podría utilizarse para medir los niveles de_H2O₂ en tipos de células y tejidos específicos mediante la generación de animales transgénicos con expresión de biosensores específicos de tejidos. Como el pez cebra facilita las manipulaciones genéticas y de desarrollo, el enfoque demostrado aquí podría servir como una tubería para probar el papel de H₂O₂ durante el desarrollo embrionario neuronal y general en vertebrados.

Introduction

La señalización reactiva de especies de oxígeno (ROS) regula el desarrollo y el funcionamiento del sistema nervioso¹. Una fuente celular importante de ROS son las NADPH oxidasas (NOX), que son proteínas transmembrana que generan superóxido y peróxido de hidrógeno_(H2O₂₎^2. Las enzimas NOX se encuentran en todo el sistema nervioso central (SNC), y el ROS derivado de NOX contribuye al desarrollo neuronal^3,4,5,6. Se ha demostrado que el mantenimiento y la diferenciación de las células madre neurales, el establecimiento de la polaridad neuronal, la excrecencia de la neurita y la plasticidad sináptica requieren niveles adecuados de ROS^7,8,9,10,11. Por otro lado, la producción incontrolada de ROS por los NOXes contribuye a trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple y la lesión cerebral traumática^12,13,14. Por lo tanto, la producción de ROS fisiológicamente relevante es fundamental para mantener condiciones saludables.

El desarrollo de biosensores codificados genéticamente facilitó enormemente la detección de ROS celular. Una ventaja importante de los biosensores codificados genéticamente es el aumento de la resolución temporal y espacial de la señal ROS, ya que estos sensores se pueden dirigir específicamente a ubicaciones distintas. GFP sensible a redox (roGFP) es un tipo de estos biosensores ROS. La variante roGFP2-Orp1 detecta específicamente_H2O2 a través de su dominio Orp1, que es una proteína de la familia glutatión peroxiredoxina de la levadura^15,16. La oxidación de la proteína Orp1 se transfiere a roGFP2 para alterar su conformación (Figura 1A). La sonda exhibe dos picos de excitación cercanos a 405 nm y 480 nm, y un solo pico de emisión a 515 nm. Tras la oxidación, la intensidad de fluorescencia alrededor de los picos de excitación cambia: mientras que la excitación de 405 nm aumenta, la excitación de 480 nm disminuye. Por lo tanto, roGFP2-Orp1 es un biosensor ratiométrico, y los niveles de_H2O₂se detectan por la relación de intensidades de fluorescencia excitadas en dos longitudes de onda diferentes (Figura 1B). En general, roGFP2-Orp1 es una herramienta versátil para imágenes ROS que se puede utilizar de manera eficiente in vivo.

Figura 1:Representación esquemática y espectros de excitación de roGFP2-Orp1. (A)La transferencia de oxidantes se produce entre Orp1 y roGFP2 en respuesta a_H2O_2,dando lugar a cambios conformacionales en roGFP2. (B) Los espectros de excitación del roGFP2-Orp1 exhiben dos picos de excitación a 405 nm y 480 nm y un pico de emisión única a 515 nm. Tras la oxidación por_H2O₂, la excitación de 405 nm aumenta mientras que la excitación de 480 nm disminuye. Esto da lugar a una lectura ratiometric para la presencia de_H2O_2. La cifra ha sido modificada de Bilan y Belousov (2017)¹⁶ y Morgan et al. (2011)²⁵. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

El sistema modelo Danio rerio (pez cebra) tiene varias ventajas para aplicar biosensores codificados genéticamente. La transparencia óptica de los embriones y larvas permite la obtención de imágenes in vivo no invasivas. Se están desarrollando nuevas herramientas de imagen para lograr una mayor resolución y una penetración más profunda¹⁷. Además, existen herramientas establecidas para la manipulación genética (expresión ectópica de ARNm, transgénesis de Tol2, etc.) y la edición del genoma (TALENs, CRISPR/Cas9, etc.), que promueve la generación de animales transgénicos¹⁸. A medida que los embriones de pez cebra se desarrollan fuera de la madre, este sistema permite aún más el acceso y la manipulación de los embriones. Por ejemplo, las inyecciones en etapa unicelular y los tratamientos farmacológicos se pueden hacer fácilmente.

Aquí, utilizamos pez cebra para expresar transitoriamente el H₂O₂-biosensores específicos roGFP2-Orp1 mediante la inyección de ARNm transcrito in vitro. Estos embriones se pueden utilizar tanto para la obtención de imágenes in vitro de neuronas cultivadas como para la obtención de imágenes in vivo (Figura 2). Se describe un protocolo para la disección y chapado de células ganglionares de la retina (RGCs) de embriones de pez cebra seguido de la evaluación de H₂O₂– niveles en neuronas cultivadas. Entonces, presentamos un método para la proyección de imagen in vivo de roGFP2-Orp1-expresando embriones y larvas usando microscopia confocal. Este enfoque no sólo permite determinar los niveles fisiológicos de_H2O_2-sino también los cambios potenciales que ocurren en diferentes etapas o condiciones de desarrollo. En general, este sistema proporciona un método confiable para detectar_H2O₂ en células vivas y animales para estudiar el papel de_H2O₂ en el desarrollo, la salud y la enfermedad.

Figura 2. Esquema del enfoque experimental. Brevemente, después de la recolección de embriones, roGFP2-Orp1 ARNm se inyecta en la yema de los embriones de pez cebra en etapa unicelular. Los embriones en desarrollo se pueden utilizar tanto para(A) imágenes in vitro como(B) in vivo. (A)Los embriones GFP-positivos se utilizan para diseccionar retinas para la colección de RGC en 34 hpf. Los RGCs disociados se platean en cubrebocas recubiertas de PDL/laminina en medios ZFCM (+). La proyección de imagen del cono del crecimiento se puede conducir mientras que RGCs extiende sus axones después de 6-24 h de la galjanoplastia. Las células pueden ser sometidas a diferentes tratamientos para medir los posibles cambios en los niveles de_H2O_2.- Aquí, medimos H₂O₂-niveles en los conos de crecimiento de RGCs (rojo). (B)Los embriones positivos de GFP se utilizan para la obtención de imágenes in vivo. A la edad deseada, los embriones pueden anestesiarse y montarse en platos con fondo de vidrio de 35 mm para obtener imágenes confocales. Aquí, los embriones se montan ventralmente para la proyección de imagen retiniana. Schematic muestra el desarrollo de la retina en el pez cebra. Los RGCs forman la capa de la célula del ganglio (GCL), que es la capa más interna en retina. Los axones de RGC se convierten en nervio óptico para cruzar midline, formando quiasma óptico. Entonces, los axones de RGC crecen dorsalmente para hacer sinapsis en el tectum óptico en el mesencéfano. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Protocol

Todos los experimentos con animales fueron revisados éticamente y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Purdue (PACUC), siguiendo las directrices de los NIH con el protocolo 2006002050 aprobado el 24/07/2020. 1. Preparación de soluciones Medios E2 (1x) Prepare soluciones de 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) y 500x E2C (100 mL) combinando todos los componentes que se muestran en la Tabla 1. Soluciones de autoclave E2A, E2B y E2C. Conser…

Representative Results

Los RGCs de pez cebra cultivados extienden axones dentro de 1d. En la Figura 4A se muestra una imagen representativa de la relación 405/480 del biosensor H2O2. El cuerpo celular, el axón y los conos de crecimiento son claramente visibles en las neuronas individuales. Estas neuronas pueden ser sometidas a diferentes tratamientos a lo largo del tiempo para monitorizar los cambios deH2O2. Anteriormente encontramos que la adición de 100 μM H2…

Discussion

Hay varios pasos críticos que necesitan atención a lo largo de este protocolo. Creemos que teniendo en cuenta estos puntos mejorará el flujo experimental. Para el cultivo primario de RGC, la esterilidad de la ZFCM (-) es muy importante, ya que este medio de cultivo no contiene antibióticos y la contaminación puede ocurrir antes o durante la toma de imágenes. Para evitarlo, aconsejamos preparar y utilizar ZFCM(-) sólo dentro de un gabinete de bioseguridad y hacer medios ZFCM(-) frescos regularmente (Paso 1.5). Adem…

Materials

35-mm culture dish	Sarstedt	83-3900
35-mm glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Cover glass	Corning	2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	26140087
Glucose	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Injection Mold	Adaptive Science Tools	TU-1
Inverted Microscope	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Low melting agarose	Promega	V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Phenol Red	Sigma Aldich	P0290
Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldich	P7629
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	PV820
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma Aldich	P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Recombinant mouse slit2	R&D Systems	5444-SL-050
Sodium Pyruvate	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0.22 µm filter	Millipore	S2GPT05RE
TE Buffer	Ambion	AM9860
Tricaine Methanesulfonate	Sigma Aldich	E10521
Vertical Pipette Puller	David Kopf Instruments	700C