एंडोन्यूक्लियज़-आधारित साइट-विशिष्ट डीएनए क्षति की कल्पना और मात्रा निर्धारित करना
Summary
यह लेख इम्यूनोस्टेपिंग और क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन के आवश्यक चरणों का परिचय देता है। इन प्रोटोकॉल आमतौर पर डीएनए क्षति से संबंधित सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने और कल्पना और डीएनए की मरंमत में फंसा प्रोटीन की भर्ती की मात्रा के लिए उपयोग किया जाता है ।
Abstract
कोशिकाओं को लगातार विभिन्न डीएनए हानिकारक एजेंटों के संपर्क में हैं, विभिन्न सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं। जैव रासायनिक और आनुवंशिक दृष्टिकोण लागू करने की भर्ती और डीएनए क्षति की साइट पर डीएनए मरम्मत परिसरों की विधानसभा के साथ जुड़े सेलुलर घटनाओं का खुलासा करने में आवश्यक है । पिछले कुछ वर्षों में, साइट-विशिष्ट डीएनए क्षति को प्रेरित करने के लिए कई शक्तिशाली उपकरण विकसित किए गए हैं। इसके अलावा, उपन्यास मौलिक तकनीकें हमें निश्चित और जीवित कोशिकाओं दोनों का उपयोग करके एकल-कोशिका संकल्प स्तर पर इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति देती हैं। यद्यपि इन तकनीकों का उपयोग विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया गया है, इसके बाद हम डीएनए मरम्मत, फ्लोरेसेंस इम्यूनोस्टेपिंग (आईएफ) और क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन (सीआईपी) के क्षेत्र में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो एंडोक्यूक्लिज-आधारित साइट-विशिष्ट डीएनए क्षति के संयोजन में निर्देशित और विनियमित फैशन में डीएनए मरम्मत कारकों की जीनोमो अधिभोग की कल्पना करना और मात्रा निर्धारित करना संभव बनाते हैं। क्रमशः। ये तकनीकें शोधकर्ताओं को क्षतिग्रस्त जीनोमिक लोकस से बंधे उपन्यास प्रोटीन की पहचान करने के साथ-साथ डीएनए मरम्मत के दौरान उनके ठीक धुन नियमन के लिए आवश्यक उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की पहचान करने के लिए शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती हैं ।
Introduction
हमारे जीनोम को विभिन्न डीएनए हानिकारक एजेंटों द्वारा लगातार चुनौती दी जा रही है । ये हमले पर्यावरणीय स्रोतों से प्राप्त हो सकते हैं, जैसे यूवी प्रकाश या विकिरण, साथ ही अंतर्जात स्रोतों से, जैसे मेटाबोलिक बाय-उत्पाद ऑक्सीडेटिव तनाव या प्रतिकृति त्रुटियों के कारण1,2। ये घाव या तो एक या दोनों डीएनए किस्में की अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं, और यदि उत्पन्न त्रुटियां लगातार हो जाती हैं, तो यह अक्सर ट्रांसलोकेशन और जीनोम अस्थिरता की ओर ले जाती है, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमरजीनेसिस3,4हो सकता है। जीनोम अखंडता को बनाए रखने के लिए, विकास के दौरान कई मरम्मत प्रणाली विकसित की गई हैं। डीएनए क्षति के विशिष्ट प्रकार के रासायनिक और भौतिक गुणों के अनुसार, कई मरम्मत तंत्र सक्रिय किया जा सकता है । बेमेल, ऑबेसिक साइटें, सिंगल-स्ट्रैंड ब्रेक, और 8-ऑक्सोगुइन (8-ऑक्सोग) को बेमेल मरम्मत या बेस-एक्सिशन रिपेयर पाथवे5,6द्वारा हटाया जा सकता है। यूवी-प्रेरित फोटोप्रोडक्ट्स और भारी-भरकम एडडक्ट्स के कारण होने वाले घावों की मरम्मत या तो न्यूक्लियोटाइड-एक्सिशन रिपेयर (एनईआर) या डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक रिपेयर (डीएसबीआर) प्रक्रिया7,8द्वारा की जा सकती है। एनईआर में दो मुख्य उप-रास्ते होते हैं: ट्रांसक्रिप्शन-युग्मित एनईआर (टीसी-एनईआर) और वैश्विक जीनोमिक एनईआर (जीजी-एनईआर)। कोशिका चक्र चरण के बारे में, डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक इंडक्शन के बाद, दो उप-मार्गों को सक्रिय किया जा सकता है: गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होना (एनएचईजे) और मुताबिक़ पुनर्संयोजन (एचआर)1,9। एनएचईजे, जो आराम कोशिकाओं में प्रमुख मार्ग है, सभी सेल चक्र चरणों में सक्रिय किया जा सकता है, जो एक तेज लेकिन त्रुटि-प्रवण मार्ग10का प्रतिनिधित्व करता है। दूसरी ओर, मानव संसाधन एक त्रुटि मुक्त मार्ग है, जिसमें डीएसबी की मरम्मत बहन क्रोमेटिड्स की अनुक्रम-होमोलॉजी खोज के आधार पर की जाती है, इसलिए यह मुख्य रूप से एस और जी-2 सेल चक्र चरणों11में मौजूद है। इसके अलावा, माइक्रोहोमोलॉजी-मध्यस्थता अंत में शामिल होने (MMEJ) एक और DSB मरम्मत तंत्र है, जो उपरोक्त लोगों से अलग है, जो एक KU70/80-और RAD51-स्वतंत्र तरीके से पहले से पुनः प्राप्त माइक्रोहोमोलॉगस दृश्यों के पुनः बंधन के आधार पर टूटा हुआ डीएनए समाप्त होता है । इसलिए, एमएमईजे को त्रुटि-प्रवण और अत्यधिक उत्परिवर्तनीय12माना जाता है। डीएनए मरम्मत के दौरान, डीएसबी डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) को प्रेरित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप चेकपॉइंट किनासे की सक्रियता होती है जोमरम्मत13,14, 15के दौरान कोशिका चक्र कोरोकतीहै। डीडीआर को भर्ती और घावों के आसपास मरम्मत प्रक्रिया के सर्जक प्रमुख खिलाड़ियों के व्यापक प्रसार के जवाब के रूप में सक्रिय किया जाता है, जो मरम्मत फोकस के गठन में योगदान देता है। इस प्रारंभिक सिग्नलिंग झरना में, एटीएम (एटैक्सिया तेलंगिएसिया म्यूटेटेड) किनेज़ घाव16के आसपास सेर139 (जिसे γH2AX के रूप में संदर्भित) में हिस्टोन संस्करण एच2एक्स के फॉस्फोरिलेशन को उत्प्रेरित करके एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह प्रारंभिक घटना अतिरिक्त मरम्मत कारकों की भर्ती और डाउनस्ट्रीम मरम्मत प्रक्रियाओं की शुरुआत के लिए जिम्मेदार है। हालांकि मरम्मत फोकस में भर्ती प्रोटीन के सटीक कार्य को अभी तक पूरी तरह से विशेषता नहीं दी गई है, लेकिन मरम्मत फोसी के गठन और गतिशीलता की कई प्रयोगशालाओं द्वारा जांच की गई है। इन मार्कर बड़े पैमाने पर मरम्मत गतिज का पालन करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन मरम्मत प्रक्रिया के दौरान उनकी सटीक भूमिका मायावी बनी हुई है। डीएनए मरम्मत से संबंधित सेलुलर प्रक्रियाओं की बहुत महत्व अभी तक खराब समझ के कारण, डीडीआर को प्रेरित करने और कल्पना करने के लिए अब तक कई तरीके विकसित किए गए हैं।
वांछित प्रकार के डीएनए क्षति को प्रेरित करने के लिए विभिन्न तरीकों और प्रणालियों की स्थापना की गई है । उदाहरण के लिए, कुछ एजेंटों [जैसे नियोकार्ज़िनोस्टैटिन (एनसीएस), फ्लेमोमाइसिन, ब्लेओमाइसिन, γ-विकिरण, यूवी] गैर-भविष्य कहनेवाला जीनोमिक पदों पर बड़ी संख्या में यादृच्छिक डीएनए ब्रेक को प्रेरित कर सकता है, जबकि अन्य (एंडोन्यूक्लिस, जैसे एएसआईएसआई, आई-पीपीओआई या आई-टीसीआई, साथ ही लेजर स्ट्रिपिंग) ज्ञात जीनोमिक लोकी17,18,19,20, 21पर डीएनए ब्रेक को प्रेरित कर सकते हैं। यहां, हम वर्तमान में स्तनधारी और खमीर कोशिकाओं में डीडीआर का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली एंडोक्यूलेज-आधारित तकनीकों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इन तकनीकों के सिद्धांतों को उजागर करने के अलावा, हम उनके फायदे और नुकसान दोनों पर जोर देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि डीएनए की मरम्मत एक अपेक्षाकृत हाल ही में अनुसंधान क्षेत्र है, हमारे ज्ञान तेजी से विभिन्न जैव रासायनिक और सूक्ष्म तरीकों की मदद से विस्तार हो रहा है। आनुवंशिक जानकारी को संरक्षित करना कोशिका?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को राष्ट्रीय अनुसंधान, विकास और नवाचार कार्यालय अनुदान GINOP-2.3.2-15-2016-00020 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, हंगरी एकेडमी ऑफ साइंसेज बो/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO अल्पकालिक फैलोशिप ८५१३, और टेम्पस फाउंडेशन के János Bolyai अनुसंधान छात्रवृत्ति ।
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
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