エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化
Summary
この記事では免疫染色とクロマチン免疫沈降の重要なステップを紹介します。これらのプロトコルは、DNA損傷関連の細胞プロセスを研究し、DNA修復に関与するタンパク質の採用を視覚化し、定量化するために一般的に使用されます。
Abstract
細胞は様々なDNA損傷剤に継続的に曝され、異なる細胞応答を誘導する。生化学的および遺伝的アプローチを適用することは、DNA損傷部位におけるDNA修復複合体の募集および組み立てに関連する細胞事象を明らかにする上で不可欠である。ここ数年、部位特異的なDNA損傷を誘発するための強力なツールが開発されました。さらに、新しい精液技術により、固定細胞と生細胞の両方を用いて、単一細胞分解能レベルでこれらのプロセスを研究することができます。これらの技術は様々な生物学的プロセスの研究に使用されてきたが、本明細書では、エンドヌクレアーゼベースのサイト特異的DNA損傷と組み合わせて、DNA修復の分野で最も広く使用されているプロトコルを提示し、指示された方法でDNA修復因子のゲノム占有率を視覚化し、定量化することを可能にする それぞれ。これらの技術は、損傷したゲノム遺伝子座に結合した新しいタンパク質を同定するための強力なツールと、DNA修復中の微調整調節に必要な翻訳後の改変を同定するための強力なツールを提供する。
Introduction
私たちのゲノムは、様々なDNA損傷剤によって絶えず挑戦されています。これらの攻撃は、紫外線や照射などの環境源、ならびに酸化ストレスまたは複製エラーによって引き起こされる代謝副産物などの内因性源から派生することができる1,2。これらの病変は、一方または両方のDNA鎖の完全性に影響を及ぼし、かつ、発生したエラーが持続する場合、転座やゲノム不安定性を頻繁に引き起こし、腫瘍形成3、4を生じる可能性がある。ゲノムの完全性を維持するために、進化の間に複数の修復システムが開発されました。特定の種類のDNA損傷の化学的および物理的特性に従って、複数の修復メカニズムを活性化することができる。不一致は、基本的な部位、一本鎖の破断、及び8-オキソグアニン(8-oxoG)は、ミスマッチ修復または塩基切除修復経路5,6によって除去することができる。UV誘導光産物および嵩高い付加物によって引き起こされる病変は、ヌクレオチド切除修復(NER)またはDNA二本鎖破断修復(DSBR)プロセス7、8によって修復することができる。NERは、転写結合型NER(TC-NER)およびグローバルゲノムNER(GG-NER)の2つの主要なサブ経路から構成されています。細胞周期相に関しては、DNA二重鎖破断誘導に続いて、2つのサブ経路を活性化することができる:非相同端接合(NHEJ)および相同組換え(HR)1,9。静止細胞における支配的な経路であるNHEJは、すべての細胞周期段階で活性化することができ、より速いがエラーが起こりやすい経路10を表す。一方、HRは、エラーのない経路であり、姉妹クロマチドの配列相同性検索に基づいてDSBが修復され、したがって主にSおよびG2細胞周期段階11に存在する。さらに、マイクロホモロジー媒介末結合(MMEJ)は、前述のものとは異なる別のDSB修復機構であり、壊れたDNA末端に隣接する以前に切除された微ホモホノラス配列のKU70/80およびRAD51独立した再結合の方法に基づく。したがって、MMEJはエラーが起こりやすいと考えられ、非常に変異性の高い12.DNA修復中に、DSBはDNA損傷応答(DDR)を誘導し、修復13、14、15の間に細胞周期を停止するチェックポイントキナーゼを活性化する。DDRは、病変の周りの修復プロセスのイニシエーターの主要プレーヤーの採用と広範な普及に対する応答として活性化され、修復焦点の形成に寄与する。この初期のシグナル伝達カスケードにおいて、ATM(運動失調毛血管拡張症変異体)キナーゼキナーゼは、病変16の周囲のSer139(γH2AXと呼ばれる)でヒストン変異体H2AXのリン酸化を触媒することによって極めて重要な役割を果たす。この初期のイベントは、追加の修復要因の募集と下流の修復プロセスの開始を担当します。修復焦点での採用タンパク質の正確な機能はまだ完全に特徴付けられていないが、修復病巣の形成とダイナミクスは、いくつかの研究所によって調査されている。これらのマーカーは、修復キネティクスに従うために広く使用されていますが、修復プロセス中の正確な役割は依然として不可解です。DNA修復関連の細胞プロセスの理解が非常に重要でありながら、DDRを誘導し、可視化するためにこれまでにいくつかの方法が開発されてきました。
所望のDNA損傷を誘発するために、様々な方法やシステムが確立されています。例えば、一部の薬剤(ネオカルジノスタチン(NCS)、フェレオマイシン、 ブレオマイシン、γ照射、UV]は、非予測的なゲノム位置で多数のランダムDNA切断を誘発し、他の(AsiSI、I-PpoIまたはI-SceI、ならびにレーザーストライピングなどのエンドヌクレアーゼ)は、既知のゲノム座17、18、19、20、21でDNA切断を誘発することができる。ここでは、哺乳類および酵母細胞におけるDDRの研究に現在用いられているエンドヌクレアーゼベースの技術に焦点を当てる。これらの技術の原理を強調する以外に、我々は彼らの長所と短所の両方を強調する。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA修復は比較的最近の研究分野ですが、様々な生化学的・顕微鏡的手法を用いて、私たちの知見は急速に広がっています。遺伝子の修復過程に関与する遺伝子に起こる変異は、腫瘍形成の主要な原因の一つであり、したがってDNA修復経路の重要なステップを解明することが不可欠であるため、遺伝情報の保存は細胞にとって極めて重要である。
生化学的手法(すなわち、?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立研究開発・イノベーション事務所の助成金GINOP-2.3.2-15-00020、GINOP-2.3.2-15-2016-00036、GINOP-2.2.1-15-2017-00052によって資金提供されました。 EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009,NKFI-FK 132080,ハンガリー科学アカデミーBO/27/20,ÚNKP-20-5-SZTE-265,EMBO短期フェローシップ8513,テンタス財団
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
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