可视化和量化基于内分泌酶的站点特定DNA损伤
Summary
本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的基本步骤。这些协议通常用于研究DNA损伤相关的细胞过程，并可视化和量化与DNA修复有关的蛋白质的招募。
Abstract
细胞不断暴露在各种DNA损伤剂中，诱导不同的细胞反应。应用生化和遗传方法对于揭示与DNA损伤现场DNA修复复合物的招募和组装相关的细胞事件至关重要。在过去几年中，已经开发出几个强大的工具来诱导特定地点的DNA损伤。此外，新的开创性技术使我们能够使用固定细胞和活细胞在单细胞分辨率水平上研究这些过程。虽然这些技术已被用于研究各种生物过程，但在此我们提出了DNA修复、荧光免疫染色 （IF） 和色度素免疫沉淀 （ChIP） 领域使用最广泛的协议，这些协议结合了基于内分泌酶的特定部位 DNA 损伤，从而能够以定向和调节的方式可视化和量化 DNA 修复因子的基因组占用率， 分别。这些技术为研究人员提供了强大的工具，以识别与受损基因组细胞落结合的新型蛋白质，以及它们在DNA修复过程中微调调节所需的转化后修饰。
Introduction
我们的基因组不断受到各种DNA破坏剂的挑战。这些攻击可能来自环境来源，如紫外线或辐照，以及内源源，如代谢副产品造成的氧化应激或复制错误1，2。这些病变会影响一个或两个DNA链的完整性，如果生成的错误变得持久，它经常导致转移和基因组不稳定，这可能导致肿瘤3，4。为了保持基因组完整性，在进化过程中开发了多个修复系统。根据特定类型DNA损伤的化学和物理特性，可以激活多个修复机制。不匹配，基本站点，单线断裂，和8-牛瓜氨酸（8-oxoG）可以通过不匹配修复或基切除修复路径5，6去除。由紫外线诱发的光产品和笨重的副产品引起的病变可以通过核苷酸切除修复 （NER） 或 DNA 双链断裂修复 （DSBR） 过程7，8来修复。NER 由两个主要子通路组成：转录耦合 NER （TC-NER） 和全球基因组 NER （GG-NER）。关于细胞周期阶段，在DNA双链断裂诱导后，可以激活两个子通路：非同源端连接（NHEJ）和同源重组（HR）1，9。NHEJ是静息细胞的主要通路，可以在所有细胞周期阶段激活，代表一个更快但容易出错的通路10。另一方面，HR是一个无差错的途径，其中DSB修复基于序列同源搜索的姐妹染色体，因此它主要存在于S和G2细胞周期阶段11。此外，微家学介质端连接 （MMEJ） 是另一种 DSB 修复机制，与上述机制不同，基于 KU70/80 和 RAD51 独立的方法，将先前重新分离的微霍洛序列重新连接在破碎的 DNA 末端两侧。因此，MMEJ被认为是容易出错和高度诱变的12。在DNA修复过程中，DSB可以诱导DNA损伤反应（DDR），这导致激活检查点激酶，在修复期间停止细胞周期13，14，15。DDR 被激活，以响应围绕病变的修复过程的发起人和发起人关键参与者的广泛传播，从而有助于形成修复重点。在这个早期的信号级联中，ATM（阿塔夏泰兰吉拉氏突变）激酶通过在病变16周围促进Histone变异H2AX（称为+H2AX）的磷化起着关键作用。这一早期事件负责招募额外的维修因素和启动下游维修流程。虽然在修复重点中招募的蛋白质的确切功能尚未完全确定，但几个实验室已经对修复foci的形成和动力学进行了调查。这些标记被广泛用于跟踪修复动能，但它们在修复过程中的精确作用仍然难以捉摸。由于对DNA修复相关细胞过程的重要性，但缺乏了解，迄今已开发出几种方法来诱导和可视化DDR。
建立了各种方法和系统来诱导所需的DNA损伤类型。例如，一些代理 [如新卡齐诺他汀 （NCS）， 异黄素， 白细胞素，γ照射，紫外线]可以诱导大量的随机DNA断裂在非预测基因组位置，而其他（内核素，如AsiSI，I-PpoI或I-SceI，以及激光剥离）可以诱导DNA断裂在已知的基因组洛西17，18，19，20，21。在这里，我们专注于目前用于研究哺乳动物和酵母细胞中的DDR的内分泌酶技术。除了强调这些技术的原则外，我们还强调它们的优点和缺点。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然DNA修复是一个相对较新的研究领域，但我们的知识正在各种生化和微观方法的帮助下迅速扩展。保存遗传信息对细胞至关重要，因为参与修复过程的基因发生突变是肿瘤的主要原因之一，因此阐明DNA修复途径的关键步骤至关重要。
生化技术（即西斑、免疫沉淀、质谱等）需要大量的细胞，所研究的修复过程是所需细胞群的快照。执行 ChIP 实验是费力的，麻烦和许多考虑?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由国家研究、开发和创新办公室资助，授予GINOP-2.3.2-15-2016-00020， GINOP-2.3.2-15-2016-00036，GINOP-2.2.1-15-2017-00052，EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-0009，NKFI-FK 132080， 匈牙利科学院的约诺斯·博利亚伊研究奖学金BO/27/20、NKP-20-5-SZTE-265、EMBO短期研究金8513和坦普斯基金会。
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
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