Visualisering og kvantificering af endonuklease-baseret stedsspecifik DNA-skade
Summary
Denne artikel introducerer væsentlige trin i immunostaining og chromatin immunoprecipitation. Disse protokoller bruges ofte til at studere DNA-skaderelaterede cellulære processer og til at visualisere og kvantificere rekrutteringen af proteiner, der er impliceret i DNA-reparation.
Abstract
Celler udsættes løbende for forskellige DNA-skadelige stoffer, hvilket fremkalder forskellige cellulære reaktioner. Anvendelse af biokemiske og genetiske tilgange er afgørende for at afsløre cellulære hændelser i forbindelse med rekruttering og samling af DNA-reparationskomplekser på stedet for DNA-skade. I de sidste par år er der udviklet flere kraftfulde værktøjer til at fremkalde stedsspecifik DNA-skade. Desuden giver nye skelsættende teknikker os mulighed for at studere disse processer på enkeltcelleopløsningsniveau ved hjælp af både faste og levende celler. Selv om disse teknikker er blevet brugt til at studere forskellige biologiske processer, præsenterer vi heri de mest anvendte protokoller inden for DNA-reparation, Fluorescens Immunostaining (IF) og Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), som i kombination med endonuklease-baseret stedsspecifik DNA-skade gør det muligt at visualisere og kvantificere den genomiske belægning af DNA-reparationsfaktorer på en målrettet og reguleret måde, henholdsvis. Disse teknikker giver forskerne effektive værktøjer til at identificere nye proteiner bundet til den beskadigede genomiske locus samt deres postoversættelsesændringer, der er nødvendige for deres finjusteringsregulering under DNA-reparation.
Introduction
Vores genom bliver konstant udfordret af forskellige DNA-skadelige stoffer. Disse angreb kan stamme fra miljømæssige kilder, såsom UV-lys eller bestråling, samt fra endogene kilder, såsom metaboliske biprodukter forårsaget af oxidativ stress eller replikationsfejl1,2. Disse læsioner kan påvirke integriteten af enten en eller begge DNA-strenge, og hvis de genererede fejl bliver vedvarende, fører det ofte til translokationer og genom ustabilitet, hvilket kan resultere i tumorigenese3,4. For at opretholde genomintegriteten er der udviklet flere reparationssystemer under udviklingen. Ifølge de kemiske og fysiske egenskaber af specifikke typer DNA-skader kan flere reparationsmekanismer aktiveres. Uoverensstemmelser, abasic steder, single-strand pauser, og 8-oxoguanine (8-oxoG) kan fjernes enten ved mismatch reparation eller base-excision reparation vej5,6. Læsioner forårsaget af UV-inducerede fotoprodukter og voluminøse addukter kan repareres enten ved nukleotid-excision reparation (NER) eller DNA dobbelt-streng break repair (DSBR) proces7,8. NER består af to hovedunderveje: transskriptionskoblet NER (TC-NER) og global genomisk NER (GG-NER). Med hensyn til cellecyklusfasen kan to underveje efter induktion af DNA-dobbeltstrengsbrud aktiveres: ikke-homolog endeføjning (NHEJ) og homolog rekombination (HR)1,9. NHEJ, som er den dominerende vej i hvileceller, kan aktiveres i alle cellecyklusfaser, hvilket repræsenterer en hurtigere, men fejlbehæftet vej10. På den anden side er HR en fejlfri vej, hvor DSB’erne repareres baseret på sekvens-homologi søgning af søsterkromatiderne, derfor er den hovedsageligt til stede i S- og G2-cellecyklusfaser11. Desuden er mikrohomologimedieret endeføjning (MMEJ) en anden DSB-reparationsmekanisme, der adskiller sig fra de førnævnte, baseret på en KU70/80- og RAD51-uafhængig måde at re-ligation af tidligere resected mikrohomologe sekvenser flankerende de ødelagte DNA-ender. MMEJ anses derfor for at være fejlbehæftet og meget mutagen12. Under DNA reparation, DSBs kan fremkalde DNA-skader respons (DDR), hvilket resulterer i aktivering af checkpoint kinases at standse cellecyklussen under reparation13,14,15. DDR aktiveres som en reaktion på rekrutteringen og den omfattende spredning af initiativtagerens nøgleaktører i reparationsprocessen omkring læsionerne, hvilket bidrager til dannelsen af et reparationsfokus. I denne tidlige signalering kaskade, ATM (Ataxia Telangiectasia Muteret) kinase spiller en central rolle ved at katalysere fosforylering af histone variant H2AX på Ser139 (benævnt γH2AX) omkring læsion16. Denne tidlige begivenhed er ansvarlig for rekruttering af yderligere reparationsfaktorer og påbegyndelse af downstream-reparationsprocesser. Selv om den nøjagtige funktion af de rekrutterede proteiner ved reparationsfokus endnu ikke er fuldt karakteriseret, er dannelsen og dynamikken i reparation foci blevet undersøgt af flere laboratorier. Disse markører bruges i vid udstrækning til at følge reparationskinetik, men deres præcise rolle under reparationsprocessen forbliver flygtig. På grund af den store betydning, men dårlig forståelse af DNA reparation-relaterede cellulære processer, flere metoder er blevet udviklet hidtil at fremkalde og visualisere DDR.
Forskellige metoder og systemer er blevet etableret for at fremkalde den ønskede type DNA-skade. For eksempel, nogle agenter [såsom neocarzinostatin (NCS), phleomycin, bleomycin, γ-bestråling, UV] kan fremkalde et stort antal tilfældige DNA-brud på ikke-prædiktive genomiske positioner, mens andre (endonukleaser, såsom AsiSI, I-PpoI eller I-SceI, samt laserstribe) kan fremkalde DNA-brud på kendte genomiske loci17,18,19,20,21. Her fokuserer vi på de endonuklease-baserede teknikker, der i øjeblikket bruges til at studere DDR i pattedyrs- og gærceller. Bortset fra at fremhæve principperne for disse teknikker, understreger vi både deres fordele og ulemper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selvom DNA-reparation er et relativt nyt forskningsfelt, udvides vores viden hurtigt ved hjælp af forskellige biokemiske og mikroskopiske metoder. Bevarelse af genetisk information er afgørende for celler, da mutationer, der forekommer i gener, der er involveret i reparationsprocesser, er blandt de førende årsager til tumorigenese, og derfor er det vigtigt at belyse de vigtigste trin i DNA-reparationsveje.
Biokemiske teknikker (dvs. vestlige blot, immunoprecipitation, massespektrometri osv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev finansieret af Det Nationale Forsknings-, Udviklings- og Innovationskontors tilskud GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, János Bolyai-forskningsstipendatet fra det ungarske videnskabsakademi BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO’s kortfristede stipendium 8513 og Tempus-fonden.
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
- Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
- Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
- Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the ‘end’, it’s a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
- Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
- Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Ricerca sul cancro. , (2020).
- Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
- Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
- Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
- Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
- Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
- Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
- Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
- Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein–DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).
