Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade
Summary
Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.
Abstract
Cellen worden continu blootgesteld aan verschillende DNA-schadelijke stoffen, waardoor verschillende cellulaire reacties worden afgeleid. Het toepassen van biochemische en genetische benaderingen is essentieel bij het onthullen van cellulaire gebeurtenissen die verband houden met de rekrutering en assemblage van DNA-reparatiecomplexen op de plaats van DNA-schade. In de afgelopen jaren zijn verschillende krachtige tools ontwikkeld om plaatsspecifieke DNA-schade te veroorzaken. Bovendien stellen nieuwe baanbrekende technieken ons in staat om deze processen op het niveau van de resolutie van één cel te bestuderen met behulp van zowel vaste als levende cellen. Hoewel deze technieken zijn gebruikt om verschillende biologische processen te bestuderen, presenteren we hierin de meest gebruikte protocollen op het gebied van DNA-reparatie, Fluorescentie Immunostaining (IF) en Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP), die in combinatie met endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade het mogelijk maken om de genomische bezetting van DNA-reparatiefactoren op een gerichte en gereguleerde manier te visualiseren en te kwantificeren, respectievelijk. Deze technieken bieden krachtige instrumenten voor de onderzoekers om nieuwe eiwitten te identificeren die gebonden zijn aan de beschadigde genomische locus, evenals hun post-translationele modificaties die nodig zijn voor hun fine-tune regulatie tijdens DNA-reparatie.
Introduction
Ons genoom wordt voortdurend uitgedaagd door verschillende DNA-schadelijke stoffen. Deze aanvallen kunnen afkomstig zijn van omgevingsbronnen, zoals UV-licht of bestraling, evenals van endogene bronnen, zoals metabolische bijproducten veroorzaakt door oxidatieve stress of replicatiefouten1,2. Deze laesies kunnen de integriteit van een of beide DNA-strengen beïnvloeden, en als de gegenereerde fouten persistent worden, leidt dit vaak tot translocaties en genoominstabiliteit, wat kan leiden tot tumorigenese3,4. Om de genoomintegriteit te behouden, zijn tijdens de evolutie meerdere reparatiesystemen ontwikkeld. Afhankelijk van de chemische en fysische eigenschappen van specifieke soorten DNA-schade kunnen meerdere reparatiemechanismen worden geactiveerd. Mismatches, abasische sites, single-streng breaks, en 8-oxoguanine (8-oxoG) kan worden verwijderd door mismatch reparatie of base-excisie reparatie pad5,6. Laesies veroorzaakt door UV-geïnduceerde fotoproducten en omvangrijke adducten kunnen worden hersteld door nucleotide-excisiereparatie (NER) of DNA-dubbelstrengsbreukreparatie (DSBR) proces7,8. NER bestaat uit twee hoofdsubtrajecten: transcriptiegekoppelde NER (TC-NER) en global genomic NER (GG-NER). Wat de celcyclusfase betreft, kunnen na DNA-dubbelstrengs breukinductie twee subroutes worden geactiveerd: niet-homologe eindvoeging (NHEJ) en homologe recombinatie (HR)1,9. NHEJ, de dominante route in rustcellen, kan in alle celcyclusfasen worden geactiveerd, wat een snellere maar foutgevoelige route10vertegenwoordigt. Aan de andere kant is HR een foutloos traject, waarbij de DSB’s worden gerepareerd op basis van sequence-homology search van de zusterchromatiden, daarom is het voornamelijk aanwezig in S- en G2-celcyclusfasen11. Bovendien is microhomologie-gemedieerde eindvoeging (MMEJ) een ander DSB-reparatiemechanisme, onderscheiden van de bovengenoemde, gebaseerd op een KU70/80- en RAD51-onafhankelijke manier om eerder gereseceerde microhomologe sequenties die de gebroken DNA-uiteinden flankeren, opnieuw te ligeren. Daarom wordt MMEJ beschouwd als foutgevoelig en zeer mutageen12. Tijdens DNA-reparatie kunnen DSB’s de DNA-schaderespons (DDR) induceren, wat resulteert in de activering van checkpointkinases die de celcyclus stoppen tijdens reparatie13,14,15. De DDR wordt geactiveerd als reactie op de werving en uitgebreide verspreiding van belangrijke initiatorspelers van het reparatieproces rond de laesies, wat bijdraagt aan de vorming van een reparatiefocus. In deze vroege signaleringscascade speelt de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) kinase een cruciale rol door de fosforylering van de histonvariant H2AX bij Ser139 (aangeduid als γH2AX) rond de laesie16te katalyseren. Deze vroege gebeurtenis is verantwoordelijk voor de werving van aanvullende reparatiefactoren en het starten van downstream reparatieprocessen. Hoewel de exacte functie van de gerekruteerde eiwitten bij de reparatiefocus nog niet volledig is gekarakteriseerd, zijn de vorming en de dynamiek van reparatie foci onderzocht door verschillende laboratoria. Deze markers worden veel gebruikt om de reparatiekinetiek te volgen, maar hun precieze rol tijdens het reparatieproces blijft ongrijpbaar. Vanwege het grote belang en toch een slecht begrip van DNA-reparatiegerelateerde cellulaire processen, zijn er tot nu toe verschillende methoden ontwikkeld om de DDR te induceren en te visualiseren.
Er zijn verschillende methoden en systemen opgezet om het gewenste type DNA-schade op te wekken. Sommige middelen [zoals neocarzinostatine (NCS), fleomycine, bleomycine, γ-bestraling, UV] kunnen bijvoorbeeld grote aantallen willekeurige DNA-breuken induceren op niet-voorspellende genomische posities, terwijl andere (endonucleases, zoals AsiSI, I-PpoI of I-SceI, evenals laserstriping) DNA-breuken kunnen induceren bij bekendegenomische loci17,18 , 19,20. Hier richten we ons op de op endonuclease gebaseerde technieken die momenteel worden gebruikt om de DDR in zoogdier- en gistcellen te bestuderen. Afgezien van het benadrukken van de principes van deze technieken, benadrukken we zowel hun voor- als nadelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel DNA-reparatie een relatief recent onderzoeksveld is, breidt onze kennis zich snel uit met behulp van verschillende biochemische en microscopische methoden. Het behoud van genetische informatie is cruciaal voor cellen, omdat mutaties in genen die betrokken zijn bij reparatieprocessen een van de belangrijkste oorzaken van tumorigenese zijn en daarom is het ophelderen van de belangrijkste stappen van DNA-reparatieroutes essentieel.
Biochemische technieken (d.w.z. westerse vlek, immunopreci…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Nationaal Bureau voor Onderzoek, Ontwikkeling en Innovatie ginop-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, de János Bolyai Research Scholarship van de Hongaarse Academie van Wetenschappen BO/27/20, ÚNKP-20-5-S
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
- Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
- Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
- Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the ‘end’, it’s a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
- Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
- Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Ricerca sul cancro. , (2020).
- Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
- Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
- Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
- Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
- Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
- Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
- Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
- Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein–DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).
