Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden
Summary
Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.
Abstract
Zellen sind kontinuierlich verschiedenen DNA-schädigenden Wirkstoffen ausgesetzt, die unterschiedliche zelluläre Reaktionen hervorrufen. Die Anwendung biochemischer und genetischer Ansätze ist unerlässlich, um zelluläre Ereignisse aufzudecken, die mit der Rekrutierung und Montage von DNA-Reparaturkomplexen an der Stelle von DNA-Schäden verbunden sind. In den letzten Jahren wurden mehrere leistungsfähige Werkzeuge entwickelt, um ortsspezifische DNA-Schäden zu induzieren. Darüber hinaus ermöglichen uns neuartige bahnbrechende Techniken, diese Prozesse auf der Ebene der Einzelzellauflösung sowohl mit festen als auch mit lebenden Zellen zu untersuchen. Obwohl diese Techniken zur Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse eingesetzt wurden, stellen wir hier die am weitesten verbreiteten Protokolle auf dem Gebiet der DNA-Reparatur, des Fluoreszenzimmunfärbungs (IF) und der Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) vor, die es in Kombination mit endonukleasebasierten ortsspezifischen DNA-Schäden ermöglichen, die genomische Belegung von DNA-Reparaturfaktoren gezielt und reguliert zu visualisieren und zu quantifizieren. beziehungsweise. Diese Techniken bieten den Forschern leistungsfähige Werkzeuge, um neuartige Proteine zu identifizieren, die an den beschädigten genomischen Locus gebunden sind, sowie ihre post-translationalen Modifikationen, die für ihre Feinabstimmung während der DNA-Reparatur erforderlich sind.
Introduction
Unser Genom wird ständig durch verschiedene DNA-schädigende Wirkstoffe herausgefordert. Diese Angriffe können von Umweltquellen wie UV-Licht oder Bestrahlung sowie von endogenen Quellen wie metabolischen Nebenprodukten, die durch oxidativen Stress oder Replikationsfehler verursacht werden, stammen1,2. Diese Läsionen können die Integrität eines oder beider DNA-Stränge beeinträchtigen, und wenn die erzeugten Fehler persistent werden, führt dies häufig zu Translokationen und Genominstabilität, was zu Tumorgenese führen kann3,4. Um die Integrität des Genoms zu erhalten, wurden während der Evolution mehrere Reparatursysteme entwickelt. Entsprechend den chemischen und physikalischen Eigenschaften bestimmter Arten von DNA-Schäden können mehrere Reparaturmechanismen aktiviert werden. Mismatches, abasic stellen, Einzelstrangbrüche und 8-Oxoguanin (8-OxoG) können entweder durch Mismatch-Reparatur oder Base-Exzisions-Reparaturweg5,6entfernt werden. Läsionen, die durch UV-induzierte Photoprodukte und sperrige Addukte verursacht werden, können entweder durch Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) oder DNA-Doppelstrangbruchreparatur (DSBR) repariert werden7,8. NER besteht aus zwei Hauptsubwegen: transkriptionsgekoppeltes NER (TC-NER) und globales genomisches NER (GG-NER). In Bezug auf die Zellzyklusphase können nach der DNA-Doppelstrangbruchinduktion zwei Subwege aktiviert werden: nicht-homologe Endfügung (NHEJ) und homologe Rekombination (HR)1,9. NHEJ, der dominante Weg in ruhenden Zellen, kann in allen Zellzyklusphasen aktiviert werden und stellt einen schnelleren, aber fehleranfälligen Weg dar10. Auf der anderen Seite ist HR ein fehlerfreier Weg, bei dem die DSBs basierend auf der Sequenz-Homologie-Suche der Schwesterchromatiden repariert werden, daher ist es hauptsächlich in den S- und G2-Zellzyklusphasen11vorhanden. Darüber hinaus ist das mikrohomologievermittelte Endfügen (MMEJ) ein weiterer DSB-Reparaturmechanismus, der sich von den oben genannten unterscheidet und auf einer KU70/80- und RAD51-unabhängigen Art der Religatur von zuvor resezierten mikrohomologen Sequenzen basiert, die die gebrochenen DNA-Enden flankieren. Daher gilt MMEJ als fehleranfällig und sehr mutagen12. Während der DNA-Reparatur können DSBs die DNA-Schadensreaktion (DDR) induzieren, was zur Aktivierung von Checkpoint-Kinasen führt, die den Zellzyklus während der Reparatur stoppen13,14,15. Die DDR wird als Reaktion auf die Rekrutierung und extensive Verbreitung von Initiator-Schlüsselakteuren des Reparaturprozesses um die Läsionen aktiviert und trägt zur Bildung eines Reparaturfokus bei. In dieser frühen Signalkaskade spielt die ATM-Kinase (Ataxia Telangiectasia Mutated) eine zentrale Rolle, indem sie die Phosphorylierung der Histonvariante H2AX bei Ser139 (γH2AX genannt) um die Läsion16katalysiert. Dieses frühe Ereignis ist verantwortlich für die Rekrutierung zusätzlicher Reparaturfaktoren und die Initiierung nachgelagerter Reparaturprozesse. Obwohl die genaue Funktion der rekrutierten Proteine im Reparaturfokus noch nicht vollständig charakterisiert ist, wurden die Bildung und die Dynamik von Reparaturherden von mehreren Laboren untersucht. Diese Marker werden ausgiebig verwendet, um die Reparaturkinetik zu verfolgen, aber ihre genaue Rolle während des Reparaturprozesses bleibt schwer fassbar. Aufgrund der großen Bedeutung, aber des schlechten Verständnisses von DNA-Reparatur-bezogenen zellulären Prozessen wurden bisher mehrere Methoden entwickelt, um die DDR zu induzieren und zu visualisieren.
Verschiedene Methoden und Systeme wurden etabliert, um die gewünschte Art von DNA-Schäden zu induzieren. Zum Beispiel können einige Wirkstoffe [wie Neocarzinostatin (NCS), Phleomycin, Bleomycin, γ-Bestrahlung, UV] eine große Anzahl von zufälligen DNA-Brüchen an nicht prädiktiven genomischen Positionen induzieren, während andere (Endonukleasen wie AsiSI, I-PpoI oder I-SceI sowie Laser striping) DNA-Brüche an bekannten genomischen Loci17,18,19,20,21induzieren können . Hier konzentrieren wir uns auf die endonukleasebasierten Techniken, die derzeit zur Untersuchung der DDR in Säugetier- und Hefezellen verwendet werden. Abgesehen davon, dass wir die Prinzipien dieser Techniken hervorheben, betonen wir sowohl ihre Vor- als auch Nachteile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl die DNA-Reparatur ein relativ neues Forschungsgebiet ist, erweitert sich unser Wissen mit Hilfe verschiedener biochemischer und mikroskopischer Methoden rasant. Die Erhaltung der genetischen Information ist für Zellen von entscheidender Bedeutung, da Mutationen, die in Genen auftreten, die an Reparaturprozessen beteiligt sind, zu den Hauptursachen für Tumorgenese gehören und daher die Aufklärung der wichtigsten Schritte von DNA-Reparaturwegen unerlässlich ist.
Biochemische Technike…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch das National Research, Development and Innovation Office Grant GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, das János Bolyai Research Scholarship der Ungarischen Akademie der Wissenschaften BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO Short-Term Fellowship 8513 und die Tempus Foundation finanziert.
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
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