엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화
Summary
이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.
Abstract
세포는 다양한 DNA 손상 제에 지속적으로 노출되어 다른 세포 반응을 유도합니다. 생화학적 및 유전적 접근을 적용하는 것은 DNA 손상의 사이트에 있는 DNA 복구 단지의 모집 그리고 조립과 관련되었던 세포 사건을 드러내는 데 필수적입니다. 지난 몇 년 동안, 몇 가지 강력한 도구는 사이트 특정 DNA 손상을 유도 하기 위해 개발 되었습니다. 더욱이, 새로운 정액 기술은 우리가 고정및 살아있는 세포를 둘 다 사용하여 단세포 분해능 수준에서 이 프로세스를 공부할 수 있게 합니다. 이러한 기술은 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 사용되었지만, 본원에서 우리는 DNA 수리 분야에서 가장 널리 사용되는 프로토콜을 제시, 형광 면역 스테인링 (IF) 및 크로마티닌 면역 침전 (ChIP), 이는 엔토뇌 기반 사이트 별 DNA 손상과 함께 DNA 의 유전 적 점유 및 DNA 의 결합을 시각화하고 정량화 할 수 있도록 DNA 수리 요소의 유전 적 점유율을 정량화 할 수 있도록 각각. 이 기술은 DNA 수리 도중 그들의 미세 조정 규칙에 필요한 그들의 번역 후 수정뿐만 아니라 손상된 게놈 궤적에 묶인 새로운 단백질을 확인하기 위하여 연구원을 위한 강력한 공구를 제공합니다.
Introduction
우리의 게놈은 다양한 DNA 손상 에이전트에 의해 끊임없이 도전되고 있습니다. 이러한 공격은 자외선 이나 조사와 같은 환경 공급원뿐만 아니라 산화 스트레스 또는 복제 오류1,2로인한 대사 부산물과 같은 내인성 소스에서 유래할 수 있다. 이러한 병변은 하나 또는 두 DNA 가닥의 무결성에 영향을 미칠 수 있으며, 생성된 오류가 지속되면 자주 전좌 및 게놈 불안정으로 이어지며 종양 발생3,4가발생할 수 있습니다. 게놈 무결성을 유지하기 위해 진화 중에 여러 수리 시스템이 개발되었습니다. DNA 손상의 특정 유형의 화학 적 및 물리적 특성에 따르면, 여러 복구 메커니즘을 활성화 할 수있다. 불일치, 기본 부위, 단일 가닥 휴식 및 8-oxoguanine(8-oxoG)은 불일치 수리 또는 기본 절제 수리 경로5,6에의해 제거될 수 있다. UV 유도 광제품에 의한 병변 및 부피가 큰 부피가 큰 유도체는 뉴클레오티드 절제 수리(NER) 또는 DNA 이중 가닥 파손 수리(DSBR) 공정7,8에의해 수리될 수 있다. NER는 전사 결합 NER(TC-NER)와 글로벌 게놈 NER(GG-NER)의 두 가지 주요 하위 경로로 구성됩니다. 세포 주기 단계에 관해서는, DNA 이중 가닥 침입 유도에 따라, 2개의 하위 통로가 활성화될 수 있습니다: 비동상화 끝 결합 (NHEJ) 및 상동성 재조합 (HR)1,9. 휴식 세포에서 지배적인 통로인 NHEJ는 모든 세포 주기 단계에서 활성화될 수 있으며, 이는 더 빠르지만 오류가 발생하기 쉬운통로(10)를나타내는 다. 한편, HR은 자매 크로마티드의 서열-상동성 검색에 기초하여 DSB를 수리하는 오류 없는 통로이며, 따라서 주로 S 및 G2 세포 주기11상에존재한다. 더욱이, 미세혼모톨로지 매개 엔드 결합(MMEJ)은 이전에 절제된 미세homologous 서열의 재구성 방법을 기반으로 앞서 언급한 것과 구별되는 또 다른 DSB 수리 메커니즘으로, 깨진 DNA 끝을 측면에 두고 있다. 따라서 MMEJ는 오류가 발생하기 쉽고 매우 돌연변이가 있는것으로 간주됩니다.12. DNA 수리 중, DSB는 DNA 손상 반응(DDR)을 유도할 수 있으며, 이는 수리13,14,15동안 세포 주기를 중단시키는 검사점 키나아제의활성화를초래한다. DDR은 병변 주위의 수리 과정의 입회기 키 플레이어의 채용 및 광범위한 확산에 대한 응답으로 활성화되어 수리 초점의 형성에 기여합니다. 이 초기 신호 캐스케이드에서 ATM(아크로바 텔란지엑시아 돌연변이) 키나제는병변(16)의주위에 Ser139(γH2AX라고 함)에서 히스톤 변종 H2AX의 인산화를 촉매하여 중추적인 역할을 한다. 이 초기 이벤트는 추가 수리 요인의 모집과 다운스트림 수리 프로세스의 개시에 대한 책임이 있습니다. 수리 초점에서 모집 된 단백질의 정확한 기능은 아직 완전히 특성화되지 않았지만, 수리 foci의 형성과 역학은 여러 실험실에서 조사되었습니다. 이러한 마커는 수리 운동학을 따르는 데 광범위하게 사용되지만 수리 과정에서 정확한 역할은 여전히 애매합니다. DNA 수리 관련 세포 과정의 중요성이 크지만 이해가 좋지 않았기 때문에 DDR을 유도하고 시각화하기 위해 지금까지 여러 가지 방법이 개발되었습니다.
원하는 유형의 DNA 손상을 유도하기 위해 다양한 방법 및 시스템이 설립되었습니다. 예를 들어, 일부 에이전트 [네오카르지노스타틴 (NCS), 플레오마이신, 블로마이신, γ 조사, UV]는 비예측 게놈 위치에서 많은 수의 무작위 DNA 브레이크를 유도할 수 있으며, 다른 사람(아시시, I-PpoI 또는 I-SceI, 레이저 스트라이프)과 같은 다른 사람(내시경)은 알려진 게놈 로시17,18,19,20,201에서DNA 절연을 유도할 수 있다. 여기에서, 우리는 포유류와 효모 세포에 있는 DDR를 공부하는 데 현재 이용된 엔도뇌리스 기지를 둔 기술에 집중합니다. 이러한 기술의 원리를 강조하는 것 외에도, 우리는 그들의 장점과 단점을 모두 강조합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA 수리는 비교적 최근의 연구 분야이지만, 우리의 지식은 다양한 생화학 적 및 현미경 방법의 도움으로 급속하게 확장되고 있습니다. 유전 정보를 보존하는 것은 복구 프로세스에 관련되나는 유전자에서 생기는 돌연변이가 종양 발생의 주요 원인 중 하나이기 때문에 세포에 중요하고 그러므로 DNA 복구 통로의 중요한 단계를 해명하는 것은 필수적입니다.
생화학 적 기술 (즉,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국가 연구 개발 및 혁신 사무소 보조금 GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, 헝가리 과학 BO/27/20의 자노스 볼라이 연구 장학금, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO 단기 펠로우십 8513, 템퍼스 재단 8513.
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
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