Visualisere og kvantifisere Endonuclease-basert stedsspesifikk DNA-skade
Summary
Denne artikkelen introduserer viktige trinn for immunstaining og kromatinimmunoprecipitation. Disse protokollene brukes ofte til å studere DNA-skaderelaterte cellulære prosesser og for å visualisere og kvantifisere rekrutteringen av proteiner som er involvert i DNA-reparasjon.
Abstract
Celler blir kontinuerlig utsatt for ulike DNA-skadelige midler, noe som induserer forskjellige cellulære responser. Bruk av biokjemiske og genetiske tilnærminger er avgjørende for å avdekke cellulære hendelser knyttet til rekruttering og montering av DNA-reparasjonskomplekser på stedet for DNA-skade. I løpet av de siste årene har flere kraftige verktøy blitt utviklet for å indusere stedsspesifikk DNA-skade. Videre tillater nye seminalteknikker oss å studere disse prosessene på encellet oppløsningsnivå ved hjelp av både faste og levende celler. Selv om disse teknikkene har blitt brukt til å studere ulike biologiske prosesser, presenterer vi heri de mest brukte protokollene innen DNA-reparasjon, Fluorescence Immunostaining (IF) og Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), som i kombinasjon med endonuclease-basert stedsspesifikk DNA-skade gjør det mulig å visualisere og kvantifisere det genomiske belegget til DNA-reparasjonsfaktorer på en rettet og regulert måte, henholdsvis. Disse teknikkene gir kraftige verktøy for forskerne å identifisere nye proteiner bundet til det skadede genomiske locus samt deres post-translasjonelle modifikasjoner som er nødvendige for deres finjustering under DNA-reparasjon.
Introduction
Genomet vårt blir stadig utfordret av ulike DNA-skadelige midler. Disse overgrepene kan komme fra miljøkilder, for eksempel UV-lys eller bestråling, samt fra endogene kilder, for eksempel metabolske biprodukter forårsaket av oksidativt stress eller replikeringsfeil1,2. Disse lesjonene kan påvirke integriteten til enten en eller begge DNA-tråder, og hvis de genererte feilene blir vedvarende, fører det ofte til translokasjoner og genom ustabilitet, noe som kan føre til tumorigenesis3,4. For å opprettholde genomintegriteten er det utviklet flere reparasjonssystemer under evolusjonen. I henhold til de kjemiske og fysiske egenskapene til bestemte typer DNA-skade, kan flere reparasjonsmekanismer aktiveres. Uoverensstemmelser, abasiske steder, pauser med én tråd og 8-oksoguanin (8-oksenG) kan fjernes enten ved reparasjon av avvik eller reparasjonsbane for grunnavgift5,6. Lesjoner forårsaket av UV-induserte fotoprodukter og store addukter kan repareres enten ved nukleotid-eksisjonsreparasjon (NER) eller DNA dobbel-strand pause reparasjon (DSBR) prosess7,8. NER består av to hovedunderveier: transkripsjonskobling NER (TC-NER) og global genomisk NER (GG-NER). Når det gjelder cellesyklusfasen, etter DNA-bruddinduksjon med dobbel tråd, kan to underveier aktiveres: ikke-homolog endekobling (NHEJ) og homolog rekombinasjon (HR)1,9. NHEJ, som er den dominerende banen i hvileceller, kan aktiveres i alle cellesyklusfaser, som representerer en raskere, men feilutsatt bane10. På den annen side er HR en feilfri vei, der DSB-ene repareres basert på sekvens-homologisøk av søsterkromotider, derfor er den hovedsakelig til stede i S- og G2-cellesyklusfaser11. Videre er mikrohomologimediert end joining (MMEJ) en annen DSB-reparasjonsmekanisme, forskjellig fra de nevnte, basert på en KU70/80- og RAD51-uavhengig måte å re-ligation av tidligere resected mikrohomologe sekvenser flankerer de ødelagte DNA-endene. Derfor anses MMEJ å være feilutsatt og svært mutagene12. Under DNA-reparasjon kan DSBer indusere DNA-skaderesponsen (DDR), noe som resulterer i aktivering av sjekkpunktkinaser som stopper cellesyklusen under reparasjon13,14,15. DDR aktiveres som et svar på rekruttering og omfattende spredning av initiator nøkkelspillere i reparasjonsprosessen rundt lesjonene, noe som bidrar til dannelsen av et reparasjonsfokus. I denne tidlige signalkaskaden spiller minibanken (Ataxia Telangiectasia Mutated) kinase en sentral rolle ved å katalysere fosforyleringen av histonevarianten H2AX på Ser139 (referert til som γH2AX) rundt lesjonen16. Denne tidlige hendelsen er ansvarlig for rekruttering av ytterligere reparasjonsfaktorer og oppstart av nedstrøms reparasjonsprosesser. Selv om den eksakte funksjonen til de rekrutterte proteinene ved reparasjonsfokuset ennå ikke er fullt karakterisert, har formasjonen og dynamikken i reparasjonsfokus blitt undersøkt av flere laboratorier. Disse markørene brukes mye til å følge reparasjonskinetikken, men deres nøyaktige rolle under reparasjonsprosessen forblir unnvikende. På grunn av den store betydningen, men likevel dårlig forståelse av DNA-reparasjonsrelaterte cellulære prosesser, har flere metoder blitt utviklet så langt for å indusere og visualisere DDR.
Ulike metoder og systemer er etablert for å indusere ønsket type DNA-skade. For eksempel kan noen midler [som neocarzinostatin (NCS), farromycin, bleomycin, γ-bestråling, UV] kan indusere et stort antall tilfeldige DNA-pauser ved ikke-prediktive genomiske posisjoner, mens andre (endonucleases, som AsiSI, I-PpoI eller I-SceI, samt laser striping) kan indusere DNA-pauser ved kjent genomisk loci17,18,19,20,21. Her fokuserer vi på de endonuclease-baserte teknikkene som for tiden brukes til å studere DDR i pattedyr og gjærceller. Bortsett fra å fremheve prinsippene for disse teknikkene, legger vi vekt på både deres fordeler og ulemper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om DNA-reparasjon er et relativt nylig forskningsfelt, utvides kunnskapen vår raskt ved hjelp av ulike biokjemiske og mikroskopiske metoder. Bevaring av genetisk informasjon er avgjørende for celler siden mutasjoner som forekommer i gener involvert i reparasjonsprosesser er blant de ledende årsakene til tumorigenesis og derfor er det viktig å belyse de viktigste trinnene i DNA-reparasjonsveier.
Biokjemiske teknikker (dvs. vestlig blot, immunoprecipitation, massespektrometri, etc.) kre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble finansiert av National Research, Development and Innovation Office grant GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080 János Bolyai Research Scholarship fra det ungarske vitenskapsakademiet BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBOs kortsiktige stipend 8513 og Tempus Foundation.
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
- Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
- Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
- Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the ‘end’, it’s a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
- Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
- Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Ricerca sul cancro. , (2020).
- Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
- Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
- Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
- Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
- Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
- Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
- Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
- Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein–DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).
