Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease
Summary
Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.
Abstract
As células são continuamente expostas a vários agentes prejudiciais ao DNA, induzindo diferentes respostas celulares. A aplicação de abordagens bioquímicas e genéticas é essencial para revelar eventos celulares associados ao recrutamento e montagem de complexos de reparação de DNA no local do dano ao DNA. Nos últimos anos, várias ferramentas poderosas foram desenvolvidas para induzir danos de DNA específicos do local. Além disso, novas técnicas seminais nos permitem estudar esses processos no nível de resolução unicelular usando células fixas e vivas. Embora essas técnicas tenham sido utilizadas para estudar vários processos biológicos, aqui apresentamos os protocolos mais amplamente utilizados no campo da reparação de DNA, Fluorescence Imunostaining (IF) e Chromatin Imunoprecipitation (ChIP), que em combinação com danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease possibilitam visualizar e quantificar a ocupação genômica de fatores de reparação de DNA de forma direcionada e regulamentada, respectivamente. Essas técnicas fornecem ferramentas poderosas para os pesquisadores identificarem novas proteínas ligadas ao lócus genômico danificado, bem como suas modificações pós-translacionais necessárias para sua regulação de ajuste fino durante a reparação do DNA.
Introduction
Nosso genoma está constantemente sendo desafiado por vários agentes prejudiciais ao DNA. Esses ataques podem derivar de fontes ambientais, como luz UV ou irradiação, bem como de fontes endógenas, como subprodutos metabólicos causados por estresse oxidativo ou erros de replicação1,2. Essas lesões podem afetar a integridade de um ou ambos os fios de DNA, e se os erros gerados se tornarem persistentes, muitas vezes levam a translocações e instabilidade do genoma, o que pode resultar em tumorigênese3,4. Para manter a integridade do genoma, vários sistemas de reparo foram desenvolvidos durante a evolução. De acordo com as propriedades químicas e físicas de tipos específicos de dano de DNA, múltiplos mecanismos de reparação podem ser ativados. Incompatibilidades, locais abasic, quebras de fios únicos e 8-oxoguanina (8-oxoG) podem ser removidos por reparo de incompatibilidade ou via de reparo de excisão base5,6. Lesões causadas por fotoprodutos induzidos por UV e adutos volumosos podem ser reparadas pelo reparo nucleotídeo-excisão (NER) ou pelo processo de quebra de dois fios (DSBR) de DNA7,8. O NER consiste em duas subseções principais: NER (TC-NER) e NER genômica global (GG-NER). Em relação à fase do ciclo celular, após a indução de quebra de duplo fio do DNA, duas subsomidas podem ser ativadas: junção final não homólogo (NHEJ) e recombinação homólogo (HR)1,9. O NHEJ, que é o caminho dominante nas células de descanso, pode ser ativado em todas as fases do ciclo celular, representando uma via mais rápida, mas propensa a erros10. Por outro lado, o RH é uma via livre de erros, na qual os DSBs são reparados com base na pesquisa seqüencial-homologia dos cromátides irmãs, portanto está presente principalmente nas fases de ciclo celular S e G211. Além disso, a junção final mediada pela microhomologia (MMEJ) é outro mecanismo de reparo DSB, distinto dos mencionados, baseado em uma maneira ku70/80 e RAD51 independente de religação de sequências microhomologos anteriormente resseccionadas flanqueando as extremidades de DNA quebradas. Portanto, o MMEJ é considerado propenso a erros e altamente mutagênico12. Durante o reparo do DNA, os DSBs podem induzir a resposta a danos de DNA (DDR), que resulta na ativação de quinases de ponto de verificação que param o ciclo celular durante o reparo13,14,15. O DDR é ativado como resposta ao recrutamento e ampla disseminação dos principais atores iniciadores do processo de reparo em torno das lesões, contribuindo para a formação de um foco de reparo. Nesta cascata de sinalização inicial, o ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) quinase desempenha um papel fundamental ao catalisar a fosforilação da variante histone H2AX em Ser139 (referida como γH2AX) em torno da lesão16. Este evento inicial é responsável pelo recrutamento de fatores adicionais de reparo e pelo início de processos de reparo a jusante. Embora a função exata das proteínas recrutadas no foco de reparo ainda não tenha sido totalmente caracterizada, a formação e a dinâmica dos focos de reparação têm sido investigadas por diversos laboratórios. Estes marcadores são amplamente usados para seguir a cinética de reparo, mas seu papel preciso durante o processo de reparo permanece indescritível. Devido à grande importância, mas má compreensão dos processos celulares relacionados à reparação de DNA, vários métodos foram desenvolvidos até agora para induzir e visualizar o DDR.
Vários métodos e sistemas foram estabelecidos para induzir o tipo desejado de dano de DNA. Por exemplo, alguns agentes [como neocarzinostatina (NCS), fleomicina, bleomicina, γ-irradiação, UV] podem induzir um grande número de quebras aleatórias de DNA em posições genômicas não preditivas, enquanto outras (endonucleases, como AsiSI, I-PpoI ou I-SceI, bem como tira laser) podem induzir quebras de DNA em loci genômica conhecida17,18,19,20,21. Aqui, focamos nas técnicas baseadas em endonuclease atualmente utilizadas para estudar o DDR em células de mamíferos e leveduras. Além de destacar os princípios dessas técnicas, enfatizamos suas vantagens e desvantagens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora a reparação de DNA seja um campo de pesquisa relativamente recente, nosso conhecimento está se expandindo rapidamente com a ajuda de vários métodos bioquímicos e microscópicos. Preservar informações genéticas é crucial para as células, uma vez que mutações que ocorrem em genes envolvidos em processos de reparação estão entre as principais causas da tumorigênese e, portanto, elucidar os passos-chave das vias de reparação do DNA é essencial.
Técnicas bioquímicas (ou…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Escritório Nacional de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação, que concede GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, a Bolsa de Pesquisa János Bolyai da Academia Húngara de Ciências BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, bolsa de curto prazo da EMBO 8513 e a Fundação Tempus.
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
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