Визуализация и количественная оценка повреждения ДНК на основе эндонуклеазы
Summary
В этой статье представлены основные этапы иммуноокрашивания и иммунопреципитации хроматина. Эти протоколы обычно используются для изучения клеточных процессов, связанных с повреждением ДНК, а также для визуализации и количественной оценки набора белков, связанных с репарацией ДНК.
Abstract
Клетки постоянно подвергаются воздействию различных повреждающих ДНК агентов, вызывая различные клеточные реакции. Применение биохимического и генетического подходов имеет важное значение для выявления клеточных событий, связанных с набором и сборкой комплексов репарации ДНК в месте повреждения ДНК. За последние несколько лет было разработано несколько мощных инструментов, чтобы вызвать повреждение ДНК, специфичное для сайта. Более того, новые семенные методы позволяют изучать эти процессы на уровне одноклеточного разрешения с использованием как фиксированных, так и живых клеток. Хотя эти методы были использованы для изучения различных биологических процессов, здесь мы представляем наиболее широко используемые протоколы в области репарации ДНК, флуоресцентного иммуноокрашивания (IF) и иммунопреципитации хроматина (ChIP), которые в сочетании с повреждением ДНК на основе эндонуклеазы позволяют визуализировать и количественно оценивать геномную занятость факторов репарации ДНК направленным и регулируемым образом, соответственно. Эти методы предоставляют исследователям мощные инструменты для идентификации новых белков, связанных с поврежденным геномным локусом, а также их постперекренческих модификаций, необходимых для их тонкой регуляции во время репарации ДНК.
Introduction
Наш геном постоянно подвергается испытаниям со стороны различных агентов, повреждающих ДНК. Эти атаки могут происходить от источников окружающей среды, таких как ультрафиолетовый свет или облучение, а также от эндогенных источников, таких как побочные продукты метаболизма, вызванные окислительным стрессом или ошибками репликации1,2. Эти поражения могут влиять на целостность одной или обеих нитей ДНК, и если генерируемые ошибки становятся постоянными, это часто приводит к транслокациям и нестабильности генома, что может привести к опухолевомугенезу 3,4. Для поддержания целостности генома в ходе эволюции было разработано несколько систем восстановления. В соответствии с химическими и физическими свойствами конкретных типов повреждений ДНК могут быть активированы несколько механизмов репарации. Несоответствия, абосные участки, одноцепочечные разрывы и 8-оксогуанин (8-оксоГ) могут быть удалены либо путем восстановления несоответствия, либо путем восстановления основания-иссечения5,6. Поражения, вызванные УФ-индуцированными фотопродуктами и громоздкими аддуктами, могут быть восстановлены либо нуклеотидно-эксцизионной репарацией (NER), либо процессом двухцепочечного разрыва ДНК (DSBR)7,8. NER состоит из двух основных подпутей: транскрипционно-связанного NER (TC-NER) и глобального геномного NER (GG-NER). Что касается фазы клеточного цикла, то после индукции двухцепочечного разрыва ДНК могут быть активированы два подпутя: негомологичное конечное соединение (NHEJ) и гомологичная рекомбинация (HR)1,9. NHEJ, который является доминирующим путем в покоящихся клетках, может быть активирован во всех фазах клеточного цикла, представляя собой более быстрый, но подверженный ошибкампуть 10. С другой стороны, HR является безошибочным путем, в котором DSB восстанавливаются на основе поиска последовательности-гомологии сестринских хроматид, поэтому он в основном присутствует в фазах11клеточного цикла S и G2. Кроме того, микрогомологически-опосредованное конечное соединение (MMEJ) является еще одним механизмом восстановления DSB, отличным от вышеупомянутых, основанным на KU70/80- и RAD51-независимом способе повторного лигирования ранее резецированных микрогомологий последовательностей, фланкируя сломанные концы ДНК. Поэтому MMEJ считается подверженным ошибкам и очень мутагенным12. Во время репарации ДНК DSB могут индуцировать реакцию повреждения ДНК (DDR), что приводит к активации киназ контрольных точек, которые останавливают клеточный цикл во время репарации13,14,15. РДР активизируется в ответ на вербовку и широкое распространение инициаторов ключевых участников процесса ремонта вокруг поражений, способствуя формированию ремонтного очага. В этом раннем сигнальном каскаде ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) киназа играет ключевую роль, катализируя фосфорилирование варианта гистона H2AX в Ser139 (называемом γH2AX) вокруг поражения16. Это раннее событие отвечает за набор дополнительных факторов ремонта и начало процессов последующего ремонта. Хотя точная функция рекрутированных белков в центре репарации еще не полностью охарактеризована, образование и динамика репараторных очагов были исследованы несколькими лабораториями. Эти маркеры широко используются для отслеживания кинетики ремонта, но их точная роль в процессе ремонта остается неуловимой. Из-за большого значения, но плохого понимания клеточных процессов, связанных с репарацией ДНК, до сих пор было разработано несколько методов для индуцирования и визуализации ГДР.
Были созданы различные методы и системы, чтобы вызвать желаемый тип повреждения ДНК. Например, некоторые агенты [такие как неокарзиностатин (NCS), флеомицин, блеомицин, γ облучение, УФ] могут индуцировать большое количество случайных разрывов ДНК в непрогностических геномных позициях, в то время как другие (эндонуклеазы, такие как AsiSI, I-PpoI или I-SceI, а также лазерное полосание) могут вызывать разрывы ДНК в известных геномных локусах17,18,19,20,21. Здесь мы сосредоточимся на методах на основе эндонуклеазы, которые в настоящее время используются для изучения DDR в клетках млекопитающих и дрожжей. Помимо выделения принципов этих методов, мы подчеркиваем как их преимущества, так и недостатки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя репарации ДНК является относительно недавней областью исследований, наши знания быстро расширяются с помощью различных биохимических и микроскопических методов. Сохранение генетической информации имеет решающее значение для клеток, поскольку мутации, происходящие в генах, уча?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось грантом Национального офиса исследований, разработок и инноваций GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, исследовательской стипендией Яноша Больяй Венгерской академии наук BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, краткосрочной стипендией EMBO 8513 и Фондом Tempus.
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
- Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
- Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
- Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the ‘end’, it’s a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
- Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
- Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Ricerca sul cancro. , (2020).
- Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
- Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
- Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
- Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
- Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
- Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
- Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
- Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein–DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).
