Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme
Summary
Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.
Abstract
Hücreler sürekli olarak çeşitli DNA zarar verici ajanlara maruz kalarak farklı hücresel tepkilere neden oluyor. Biyokimyasal ve genetik yaklaşımların uygulanması, DNA hasarı yerinde DNA onarım komplekslerinin işe alınması ve montajı ile ilişkili hücresel olayların ortaya alınmasında esastır. Son birkaç yılda, bölgeye özgü DNA hasarına neden olacak birkaç güçlü araç geliştirilmiştir. Ayrıca, yeni ufuk açıcı teknikler, bu süreçleri hem sabit hem de canlı hücreleri kullanarak tek hücre çözünürlük düzeyinde incelememizi sağlar. Bu teknikler çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için kullanılmış olsa da, burada DNA onarımı, Floresan İmmünostaining (IF) ve Chromatin İmmün Önseçim (ChIP) alanında en yaygın kullanılan protokolleri sunuyoruz, bu da endononikleaz bazlı sahaya özgü DNA hasarı ile birlikte DNA onarım faktörlerinin genomik doluluğunun yönlendirilmiş ve düzenlenmiş bir şekilde görselleştirilmesini ve ölçülmesini mümkün kılmaktadır, sırasıyla. Bu teknikler, araştırmacıların hasarlı genomik lokusa bağlı yeni proteinleri ve DNA onarımı sırasında ince ayar düzenlemeleri için gerekli çeviri sonrası modifikasyonlarını tanımlamaları için güçlü araçlar sağlar.
Introduction
Genomumuz sürekli olarak çeşitli DNA zarar verici ajanlar tarafından zorlanıyor. Bu saldırılar, UV ışığı veya ışınlama gibi çevresel kaynaklardan ve oksidatif stres veya replikasyon hatalarından kaynaklanan metabolik yan ürünler gibi endojen kaynaklardan türetilebilir1,2. Bu lezyonlar bir veya her iki DNA teli bütünlüğünü etkileyebilir ve oluşturulan hatalar kalıcı hale gelirse, sıklıkla translokasyonlara ve genom kararsızlığına yol açar ve bu da tümöregenez3,4ile sonuçlanabilir. Genom bütünlüğünü korumak için evrim sırasında birden fazla onarım sistemi geliştirilmiştir. Belirli DNA hasarı türlerinin kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre, birden fazla onarım mekanizması etkinleştirilebilir. Uyuşmazlıklar, abasik siteler, tek iplik kopmalar ve 8 oxoguanine (8-oxoG) uyumsuz onarım veya baz eksizyon onarım yolu5,6ile çıkarılabilir. UV kaynaklı fotoprodüktürlerin ve hacimli adductların neden olduğu lezyonlar nükleotid eksizyon onarımı (NER) veya DNA çift iplikçik kırma onarımı (DSBR) işlemi ile onarılabilir7,8. NER iki ana alt yoldan oluşur: transkripsiyon bağlantılı NER (TC-NER) ve küresel genomik NER (GG-NER). Hücre döngüsü fazı ile ilgili olarak, DNA çift iplikçik kırılması indüksiyonunu takiben, iki alt yol etkinleştirilebilir: homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolog rekombinasyon (HR)1,9. Dinlenme hücrelerinde baskın yol olan NHEJ, tüm hücre döngüsü aşamalarında aktive edilebilir, daha hızlı ama hataya eğilimli bir yolu temsil eder10. Öte yandan, İk, DSB’lerin kardeş kromatların sıra-homoloji aramasına göre onarıldığı hatasız bir yoldur, bu nedenle esas olarak S ve G2 hücre döngüsü aşamalarında bulunur11. Ayrıca, mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ), kırık DNA uçlarını kuşatan daha önce resepsiyon edilmiş mikrohomolog dizilerin KU70/80 ve RAD51’den bağımsız yeniden ligasyon yoluna dayanan, yukarıda belirtilenlerden farklı başka bir DSB onarım mekanizmasıdır. Bu nedenle, MMEJ hataya eğilimli ve son derece mutajenik olarak kabul edilir12. DNA onarımı sırasında, DSB’ler DNA hasar yanıtını (DDR) indükleyebilir, bu da onarım sırasında hücre döngüsünü durduran kontrol noktası kinazlarının aktivasyonu ile sonuçlanır13,14,15. DDR, onarım sürecinin başlatıcı kilit oyuncularının lezyonlar etrafında işe alınmasına ve kapsamlı bir şekilde yayılmasına yanıt olarak etkinleştirilir ve bir onarım odağının oluşumuna katkıda girer. Bu erken sinyal çağlayanında, ATM (Ataxia Telangiectasia Mutasyona Uğramış) kinaz, Ser139’daki histone varyantı H2AX’ın fosforilasyonunu katalize ederek (φH2AX olarak adlandırılır) lezyon16etrafında önemli bir rol oynar. Bu erken olay, ek onarım faktörlerinin işe alınmasından ve aşağı akış onarım süreçlerinin başlatılmasından sorumludur. İşe alınan proteinlerin onarım odağındaki tam işlevi henüz tam olarak karakterize edilemese de, onarım odaklarının oluşumu ve dinamikleri birkaç laboratuvar tarafından araştırılmıştır. Bu belirteçler onarım kinetiğini takip etmek için yaygın olarak kullanılır, ancak onarım işlemi sırasındaki kesin rolleri zor olmaya devam etmektedir. DNA onarımı ile ilgili hücresel süreçlerin büyük öneme sahip olmasına rağmen zayıf anlaşılması nedeniyle, DDR’yi teşvik etmek ve görselleştirmek için şimdiye kadar çeşitli yöntemler geliştirilmiştir.
İstenilen DNA hasarı türünü indük etmek için çeşitli yöntem ve sistemler kurulmuştur. Örneğin, bazı ajanlar [neokarzinostatin (NCS), fenomisin, bleomisin, γ ışınlama, UV] tahmin edilemeyen genomik pozisyonlarda çok sayıda rastgele DNA kırılmasına neden olabilirken, diğerleri (AsiSI, I-PpoI veya I-SceI gibi endonikülalar ve lazer şeritleme) bilinen genomik loci17 , 18,19,20,21‘de DNA kırılmalarına neden olabilir. Burada, memeli ve maya hücrelerinde DDR’yi incelemek için şu anda kullanılan endonücleaz bazlı tekniklere odaklanıyoruz. Bu tekniklerin ilkelerini vurgulamanın yanı sıra, hem avantajlarını hem de dezavantajlarını vurguluyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA onarımı nispeten yeni bir araştırma alanı olmasına rağmen, çeşitli biyokimyasal ve mikroskobik yöntemlerin yardımıyla bilgimiz hızla genişlemektedir. Onarım süreçlerinde yer alan genlerde meydana gelen mutasyonlar tümöregenezin önde gelen nedenleri arasında yer aldığından ve bu nedenle DNA onarım yollarının temel adımlarını aydınlatmak gerekli olduğundan, genetik bilgilerin korunması hücreler için çok önemlidir.
Biyokimyasal teknikler (örneğin, batı …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Ulusal Araştırma, Geliştirme ve İnovasyon Ofisi hibe GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, Macar Bilimler Akademisi BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO kısa süreli bursu 8513 ve Tempus Vakfı’nın János Bolyai Araştırma Bursu.
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
- Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
- Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
- Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the ‘end’, it’s a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
- Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
- Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Ricerca sul cancro. , (2020).
- Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
- Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
- Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
- Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
- Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
- Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
- Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
- Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein–DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).
