मॉडल केराटिनसाइट स्टेम सेल प्लास्टिसिटी के लिए एक उच्च थ्रूपुट एपिडर्मल स्पेरोइड कल्चर सिस्टम की स्थापना
Summary
यहां हम 3डी निलंबन संस्कृति में एपिडर्मल स्फेरॉइड की व्यवस्थित खेती के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल में विभिन्न प्रकार के एपिथेलियल ऊतक प्रकारों में उपयोग के लिए और कई मानव रोगों और स्थितियों के मॉडलिंग के लिए व्यापक अनुप्रयोग हैं।
Abstract
एपिथेलियल डिस्रेगुलेशन विभिन्न प्रकार की मानव स्थितियों और बीमारियों के लिए एक नोड है, जिसमें पुरानी घायल, सूजन और सभी मानव कैंसर का 80% से अधिक शामिल है। एक अस्तर ऊतक के रूप में, त्वचा एपिथेलियम अक्सर चोट के अधीन होता है और क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत के लिए आवश्यक सेलुलर प्लास्टिसिटी प्राप्त करके विकासवादी रूप से अनुकूलित होता है। इन वर्षों में, इन विट्रो और पूर्व वीवो सेल आधारित मॉडलों का उपयोग करके एपिथेलियल प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं। हालांकि, ये प्रयास एपिथेलियल सेल प्लास्टिसिटी के विभिन्न चरणों को फिर से शुरू करने की उनकी क्षमता में सीमित रहे हैं । हम यहां प्राथमिक नवजात मानव केराटिनोसाइट्स से 3 डी एपिडर्मल स्फेरॉइड और एपिडर्मल स्पेरोइड-व्युत्पन्न कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल एपिडर्मल स्पेरोइड संस्कृतियों की क्षमता को रेखांकित करता है ताकि केराटिनसाइट जनरेटिव प्लास्टिसिटी के अलग-अलग चरणों को कार्यात्मक रूप से मॉडल किया जा सके और यह दर्शाता है कि एपिडर्मल स्पेरोइड री-प्लेटिंग इनटेग्रिने6 हाय/ईजीएफआरलो केराटिनोट उप-जनसंख्या के लिए विषम सामान्य मानव केराटिनोसाइट्स (एनएचकेसी) संस्कृतियों को समृद्ध कर सकता है। हमारी रिपोर्ट में त्वचा केराटिनोसिट प्लास्टिसिटी और एपिडर्मल पुनर्जनन के अध्ययन के लिए एक उच्च थ्रूपुट प्रणाली के विकास और रखरखाव का वर्णन किया गया है।
Introduction
स्तनधारी स्तरीकृत एपिथेलियम सभी जीवित प्रणालियों में सबसे जटिल एपिथेलियल आर्किटेक्चर है और अक्सर नुकसान और चोट के अधीन होता है। एक सुरक्षात्मक ऊतक के रूप में, एक जटिल और प्रभावी ऊतक क्षति प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए स्तरीकृत एपिथेलियम विकसित हुआ है। चोट लगने पर, इन कोशिकाओं को वंश प्लास्टिसिटी कार्यक्रमों को सक्रिय करना चाहिए, जो उन्हें घायल स्थल पर स्थानांतरित करने औरमरम्मत 1,2,3करने में सक्षम बनाता है। यह बहुआयामी प्रतिक्रिया कई अनुक्रमिक चरणों में होती है जो खराब समझ में आती हैं ।
एपिथेलियल पुनर्जनन की जटिल प्रक्रिया का अध्ययन करने में एक बड़ी बाधा उच्च थ्रूपुट मॉडल प्रणालियों की कमी में निहित है जो सेल पुनर्जनन के परिभाषित चरणों में गतिशील सेलुलर गतिविधियों को कैप्चर कर सकते हैं। जबकि वीवो माउस मॉडल में घाव भरने में प्रासंगिक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और मानव पुनर्योजी प्रक्रिया को सबसे बारीकी से पुन: कृत करते हैं, उनके विकास के लिए श्रमसाध्य प्रयासों और महत्वपूर्ण लागत की आवश्यकता होती है, जिससे उनकी थ्रूपुट क्षमता सीमित हो जाता है। इसलिए, ऐसी प्रणालियों की स्थापना की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है जो उच्च थ्रूपुट पैमाने पर मानव एपिथेलियल ऊतक उत्थान की कार्यात्मक जांच को सक्षम करती है।
हाल के वर्षों में स्केलेबिलिटी चैलेंज से निपटने के लिए कई प्रयास किए गए हैं । यह अभिनव इन विट्रो और पूर्व वीवो सेल-आधारित मॉडल के महान विस्तार के माध्यम से देखा जाता है जो वीवो पुनर्योजी संदर्भ में बारीकी से नकल करते हैं। इसमें ऑर्गन-ऑन-चिप4,स्फेरॉइड5,ऑर्गेनॉइड6और ऑर्गेनोटिपिक कल्चर्स7में प्रगति शामिल है । ये 3डी सेल-आधारित सिस्टम प्रत्येक अद्वितीय लाभ प्रदान करते हैं और अलग-अलग प्रयोगात्मक सीमाएं प्रस्तुत करते हैं। आज तक, गोलाकार संस्कृति सबसे अधिक लागत प्रभावी और व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली 3डी सेल संस्कृति मॉडल बनी हुई है। और जब कई रिपोर्टों से संकेत मिला है कि स्फेरॉइड संस्कृतियों का उपयोग त्वचा स्टेम सेल विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, इन अध्ययनों को काफी हद तक पशु ऊतक8,9,या डर्मल फाइब्रोब्लास्ट10के साथ आयोजित किया गया है, जिसमें लगभग कोई रिपोर्ट मानव एपिडरमल स्फेरॉइड संस्कृतियों के पुनर्योजी गुणों की विशेषता नहीं है। इस प्रोटोकॉल में हम सामान्य मानव केराटिनोसाइट्स (एनएचकेसी) से एपिडर्मल स्फेरॉइड संस्कृतियों के कार्यात्मक विकास, संस्कृति और रखरखाव का विस्तार करते हैं। हम इस प्रणाली की उपयोगिता का समान रूप से वर्णन करने के लिए एपिडर्मल उत्थान और केराटिनोसिटे स्टेम सेल प्लास्टिसिटी इन विट्रो के अनुक्रमिक चरणों मॉडल ।
Protocol
Representative Results
Discussion
3डी स्फेरॉइड कल्चर सिस्टम के उपयोग से सेल स्टेमनेस का आकलन करने में व्यापक उपयोगिता रही है । इन प्रणालियों को ऊतक स्टेम कोशिकाओं के संवर्धन को बढ़ाने के लिए प्रदर्शित किया गया है13,फिर भी मानव ए…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यूओएफएसी स्कूल ऑफ मेडिसिन इंस्ट्रूमेंटेशन रिसोर्स फैसिलिटी (आईआरएफ) ने इमेजिंग और सेल छंटाई उपकरण और तकनीकी सहायता तक पहुंच प्रदान की। इस काम को अनुदान द्वारा भाग में समर्थन दिया गया था 1R21CA201853। एमसीएफ और आईआरएफ को एनआईएच ग्रांट P20GM103499, SC INBRE से आंशिक समर्थन मिलता है। एमसीएफ को एनआईएच ग्रांट P20GM109091 से भी समर्थन मिलता है । Yvon Woappi एनआईएच अनुदान 2R25GM066526-06A1 (PREP) और R25GM076277 (IMSD) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, और UofSC में ग्रेस जॉर्डन McFadden प्रोफेसरों कार्यक्रम द्वारा एक फैलोशिप द्वारा । गेराल्डीन एजेका और जस्टिन वर्सेलिनो को यूओएससी में एनआईएच ग्रांट 2R25GM066526-10A1 (PREP) द्वारा समर्थित किया गया था। शॉन एम Bloos UofSC में २०१६ मैगलन विद्वान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
Riferimenti
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