Doxycyclin Loaded Kollagen-Chitosan Composite Stillads til accelereret helbredelse af diabetiske sår
Summary
Det forberedte DOX-CL stillads opfyldte forudsætningerne for en ideel DW-dressing i mekanisk styrke, porøsitet, vandabsorption, nedbrydningshastighed, vedvarende frigivelse, antibakteriel, biokompatibilitet og antiinflammatoriske egenskaber, som anses for at være afgørende for genopretningen af beskadiget væv i VW.
Abstract
En stor komplikation af diabetes mellitus er diabetiske sår (DW). Den langvarige fase af inflammation i diabetes hindrer de yderligere stadier af en skade, der fører til forsinket sårheling. Vi valgte doxycyclin (DOX), som et potentielt lægemiddel efter eget valg, på grund af dets antibakterielle egenskaber sammen med dets rapporterede antiinflammatoriske egenskaber. Den nuværende undersøgelse har til formål at formulere DOX indlæst kollagen-chitosan ikke-crosslinked (NCL) &crosslinked (CL) stilladser og evaluere deres helbredende evne i diabetiske tilstande. Karakteriseringsresultatet af stilladser afslører, at DOX-CL stilladset har ideel porøsitet, en lav hævelse og nedbrydningshastighed og en vedvarende frigivelse af DOX sammenlignet med DOX-NCL stilladset. In vitro-undersøgelserne viser, at DOX-CL-stilladset var biokompatibelt og forbedret cellevækst sammenlignet med CL-stilladsbehandlede og kontrolgrupper. De antibakterielle undersøgelser har vist, at DOX-CL stilladset var mere effektivt end CL stilladset mod de mest almindelige bakterier, der findes i DW. Ved hjælp af streptozotocin og fedtfattig kost-induceret DW model, en betydeligt (p≤0,05) hurtigere sårsammentrækning i DOX-CL stillads behandlet gruppe blev observeret i forhold til dem i CL stillads behandlet og kontrol grupper. Brugen af DOX-CL stilladset kan vise sig at være en lovende tilgang til lokal behandling af VW.
Introduction
Diabetes mellitus (DM) er en tilstand, hvor kroppens manglende evne til at levere insulin eller reagere på dens resultater i unormal fordøjelse af ligetil sukker medfører en stigning i blodsukkeret 1. Den mest på hinanden følgende og knusende sammenfiltring af DM er diabetisk sår (DW). Omkring 25% af patienter med DM har mulighed for at opbygge en DW i deres levetid 1. Den hindrede helbredelse af DW er akkrediteret til en triopati af DM: immunopati, vasculopati, og neuropati. Når DW ikke behandles, kan det resultere i koldbrandudvikling, hvilket medfører fjernelse af det pågældende organ 2.
Masser af behandlinger, såsom at instruere patienterne (inspicere sår dagligt, rense såret, undgå aktiviteter, der skaber pres på såret, periodisk glukoseovervågning osv.), kontrollere deres blodsukker, sårdebridement, trykaflastning, medicinsk procedure, hyperbar iltbehandling og avancerede terapier er i praksis 3,4. De fleste af disse medikamenter undlader at behandle alle forudsætninger afgørende for DW pleje i lyset af de multifaktorielle patofysiologiske tilstande og uventede udgifter i forbindelse med disse lægemidler 5. Selvom DW patogenese er multifaktoriel, den vedvarende betændelse med uhensigtsmæssig vævshåndtering er angivet til at være den faktiske årsag til forsinket heling i DWs 5,6.
Forstærkede niveauer af inflammatoriske og proinflammatoriske mæglere i DW resulterer i mindskede vækstfaktorer, der er ansvarlige for forsinket sårheling 2,6. Forkert ekstracellulær matrix (ECM) dannelse i VW er akkrediteret til øgede niveauer af matrix metalloproteinaser (MMP’er), der er ansvarlige for den hurtige nedbrydning af dannet ECM. I MMP’er rapporteres MMP-9 som en vigtig mellemmand med ansvar for langvarig inflammation og hurtig ECM-nedbrydning 7. Det siges, at lokal behandling med et antiinflammatorisk lægemiddel, der reducerer de forhøjede niveauer af MMP-9, genopretter kutane homøostase, rammearrangement og beder om bedre helbredelse af DWs 8,9.
Doxycyclin (DOX), en MMP-9-hæmmer, blev valgt til at undertrykke de forhøjede niveauer af MMP-9, en stor inflammatorisk mægler, der er ansvarlig for vedvarende betændelse i DWs 10,11,12. Derudover besidder DOX antioxidant (producerer frie hydroxy- og phenoxyradikaler, der er i stand til at binde sig med reaktive iltarter) 13 og antiapptotiske (hæmme caspase-udtryk og mitokondriestabilisering) 14 aktiviteter, der er afgørende for behandlingen af DW. Arrangementet af rammer, der indeholder DOX, kollagen (COL), og chitosan (CS) blev valgt. Valget af COL afhænger af den måde, hvorpå det hjælper med at skabe de nødvendige rammer for mekanisk styrke og vævsgendannelse 15. På den anden side er CS strukturelt homolog til glykosaminoglycan, forbundet med flere sårhelingsfaser. Det forlyder også, at CS har betydelig antibakteriel egenskab 15. Derfor er COL / CS stilladset af DOX formuleret til at undertrykke den langvarige inflammation, efterfulgt af støtte matrixdannelsen for vellykket sårheling under DM-forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hovedformålet med denne undersøgelse var at bestemme effekten af DOX-indlæst COL-CS stillads på DW-heling hos rotter. CL og NCL blev udarbejdet og evalueret i form af morfologi, hævelse indeks, in vitro frigivelse kinetik, og biokompatibilitet.
Karakterisering af det DOX-indlæste NCL- og CL-stillads
De forberedte stilladser viste sig at være porøse med sammenkoblede porer. Disse sammenkoblede porer sikrer den porøse, svampede natur, der hjælper med korrekt diffusi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Ashish D Wadhwani. (Adjunkt og leder, Institut for Farmaceutisk Bioteknologi, JSS College of Pharmacy, Ooty, Indien) for at bistå i In vitro celle levedygtighed undersøgelser.
Forfatterne vil gerne takke Institut for Videnskab og Teknologi – Fonden for Forbedring af Videnskab og Teknologi Infrastruktur på universiteter og højere uddannelsesinstitutioner (DST-FIST), New Delhi, for at støtte vores afdeling.
Forfatterne vil også gerne takke Mr. Sanju. S og Mr. Sriram. Narukulla M. Pharm studerende for deres støtte i videooptagelsen.
Denne forskning blev støttet af JSS Academy of Higher Education &Research (JSSAHER).
Materials
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
Riferimenti
- . IDF Diabetes Atlas, 9th edn Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019)
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the treatment of chronic wounds. Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).
- Alexiadou, K., Doupis, J. Management of diabetic foot ulcers. Diabetes Therapy. 3 (1), 1-15 (2012).
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O’Toole, E. A. Metalloproteinases and wound healing. Advances in Wound Care. 4 (4), 225-234 (2015).
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -. C., Chang, C. -. P., Lin, S. -. M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -. Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R. Clinical Perspective. Circulation. 119 (16), 2209-2216 (2009).
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
